В клинической микробиологии используются диагностические биомаркеры инфекции различной природы.
Нуклеазы - это разнообразное семейство белковых ферментов, присутствующих во всех сферах жизни, которые опосредуют деградацию нуклеиновых кислот путем расщепления фосфодиэфирных связей, составляющих их основу. Большое количество нуклеаз было идентифицировано и охарактеризовано для многих различных видов в домене Bacteria, во многих случаях играющих ключевую роль в связанном с ними патогенезе. Большое разнообразие бактериальных нуклеаз, их способность разрушать природные (ДНК или РНК) или химически модифицированные нуклеотиды (2'-фтор, 2'-O-метил, LNA и т.д.) и их разнообразные биохимические и каталитические свойства, такие как предпочтение субстрата, предпочтение последовательности, зависимость от катиона или термостабильность, делают их перспективными кандидатами в качестве диагностических биомаркеров.
Известно, что бактериальные и человеческие нуклеазы можно различать на основе профиля их нуклеазной активности, и как бактериальная нуклеазная активность, так и нуклеазные паттерны уже были использованы и предложены, соответственно, для идентификации и дискриминации между видами бактерий. Использование шаблонов бактериальной нуклеазной активности в качестве новых диагностических биомаркеров является особенно перспективным и новые подходы расширяют его потенциал для успешной идентификации и характеристики клинически значимых бактериальных патогенов.
Сообщалось о нескольких методологиях анализа активности нуклеаз, включая системы флуоресцентно-резонансного переноса энергии (FRET), которые регистрируют расщепление олигонуклеотидов; масс-спектрометрию или капиллярный электрофорез, которые обеспечивают профили фрагментации олигонуклеотидов. На основе некоторых из этих методик биосенсинговые системы, использующие бактериальную нуклеазную активность в качестве биомаркера, уже показали перспективность, дополняя существующие диагностические технологии, удовлетворяя нерешенные диагностические потребности в клинических условиях и создавая основу для новых диагностических направлений и методик. В этом контексте, благодаря своей легкодоступности в живых бактериях, внеклеточные (мембрано-ассоциированные, закрепленные на клеточной стенке и секретируемые) нуклеазы представляют собой более перспективных кандидатов, чем внутриклеточные нуклеазы, для их использования в качестве диагностических средств.
В этом обзоре мы кратко рассмотрим огромный репертуар бактериальных нуклеаз и приведем соответствующие примеры из литературы о том, как они были использованы и как они могут быть использованы в качестве диагностических биомаркеров.
Еще в 1950-х годах активность внеклеточной дезоксирибонуклеазы была предложена в качестве полезного фенотипического признака для помощи в биохимической идентификации, характеристике и дискриминации бактериальных видов в клинической микробиологии. В связи с этим за последние десятилетия были разработаны различные анализы, называемые в совокупности ДНК-тестами, для выявления нуклеазной активности, которые используются и в настоящее время.
Использование ДНК-теста было предложено в качестве средства для дискриминации Serratia spp от других видов семейства Enterobacteriaceae на основе наличия или отсутствия внеклеточной нуклеазной активности. Аналогичным образом, тест на ДНКазу был предложен как экономически эффективный и простой инструмент скрининга C. diphteria, поскольку он способен различать дифтерийные и недифтерийные коринебактерии с высокой чувствительностью (100%) и специфичностью (93,9%). И, наконец, тест на ДНКазу чаще всего использовался для специфической идентификации золотистого стафилококка (S. aureus).
Однако для преодоления проблемы специфичности, вызванной производством термолабильных внеклеточных нуклеаз микрококками и коагулазоотрицательными стафилококками, такими как Staphylococcus epidermidis, была разработана разновидность ДНКазного теста, известная как термонуклеазный тест (TNase), который использует термостабильность микрококковой нуклеазы (MN). TNase не только более специфичен, чем ДНКазный тест, но его точность, как было показано, соответствует точности пробирочного коагулазного теста (TCT) для идентификации S. aureus в пищевых продуктах и клинических изолятах грамположительных кокков. Более того, он представляет собой простую, быструю (~ 2,5 часа) и недорогую методику обнаружения MN в очень низких концентрациях (5-10 нг/г - примерно 10-3 ед/г) непосредственно из пищевых образцов, что является хорошим индикатором контаминации S. aureus, даже когда жизнеспособные бактерии уже отсутствуют после обработки продуктов питания.
Неудивительно, что тест на определение TNase был и остается очень точной, быстрой (1 -4 часа), простой и недорогой альтернативой молекулярным методам для идентификации бактериемии S. aureus из положительных культур крови, в которых обнаруживаются грамположительные кокки при прямом окрашивании по Граму. Однако продукция термостабильных нуклеаз типичными подозреваемыми в бактериемии бактериями, такими как Enterococcus faecalis и коагулазоотрицательные стафилококки, среди которых распространенность гораздо ниже и профили термостабильности отличаются, может иногда приводить к неправильной идентификации возбудителя.
В последнее время расширился спектр подходов, использующих каталитическую активность MN в качестве биомаркера для идентификации S. aureus. Некоторые недавно появившиеся платформы биосенсинга используют распознающие элементы на основе нуклеиновых кислот в сочетании с механизмами передачи данных на основе флуоресценции для качественного и количественного определения ферментативной активности MN с высокой селективностью и очень низким пределом обнаружения, составляющим от 2,9x10-3 до 2,7x10-5 ед/мл (около 0,1 нг/мл) в воспроизводимой манере. Однако в большинстве случаев их эффективность в сложных матрицах еще не подтверждена, что ограничивает их применимость для обнаружения нуклеазы S. aureus исключительно в чистых культурах.
Аналогичные подходы были применены и для других нуклеаз, таких как ДНКаза I, с добавлением новых функций, таких как мониторинг ферментативной активности в режиме реального времени. Одна из наиболее изученных и гибких платформ биосенсинга для обнаружения каталитической активности бактериальных нуклеаз основана на использовании коротких, химически модифицированных самогасящихся флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, которые могут быть легко настроены для использования в качестве специфических субстратов, что позволяет идентифицировать бактерии in vitro в сложных клинических образцах, таких как моча или плазма, а также in vivo.
Были приведены конкретные примеры использования нуклеазной активности в качестве биомаркеров для обнаружения и идентификации как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Hernandez et al. смогли определить инфекцию S. aureus in vivo, воспользовавшись каталитическими свойствами секретируемой им нуклеазы (MN) в мышиной модели пиомиозита. На основе аналогичной, но оптимизированной платформы был также создан экономичный, сверхчувствительный и высокоспецифичный тест для быстрого (3 часа) выявления бактериемии S. aureus непосредственно из необогащенной плазмы крови.
Flenker et al. также использовали эту платформу для разработки быстрого (3 часа), экономичного и простого теста, основанного на выявлении доминирующей активности хромосомно кодируемой эндонуклеазы I E. coli, для диагностики инфекции мочевыводящих путей (ИМП), вызванной этой бактерией, непосредственно из образцов мочи с минимальной предварительной обработкой. Сообщается, что чувствительность (S) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) для ИМП, вызванных кишечной палочкой (S: 97%; NPV: 98%), и общего ИМП (S: 95,3% NPV: 87,5%) эквивалентны или выше, чем при быстром анализе мочи с помощью дип-стика. Кроме того, этот метод обещает обеспечить точную идентификацию и количественное определение патогенов, при этом он податлив к автоматизации и мультиплексированию.
В то же время, Machado et al. использовали ту же биосенсорную платформу для быстрого (8 часов) и точного выявления Salmonella enterica ser. Typhimurium из чистых культур и культуральных гомогенатов брыжеечных лимфатических узлов откормочных свиней путем использования нуклеазного паттерна, ассоциированного с этой бактерией. Использование скринингового подхода для идентификации олигонуклеотидных зондов, которые предпочтительно катализируются под действием нуклеазного паттерна Salmonella enterica ser. Typhimurium, достигается идентификация патогена с уровнем точности, соответствующим методам золотого стандарта, без необходимости разбираться в этиологии ферментативной активности.
В дополнение к идентификации патогенов, та же биосенсорная платформа была использована для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам на основе двух, казалось бы, противоположных стратегий: производство нуклеазы, связанное с ростом, и высвобождение нуклеазы, связанное с лизисом. Обе стратегии оказались более быстрыми (3-6 часов) и не менее точными, чем классические фенотипические методы (например, метод микроразведений в бульоне) для получения количественной информации о чувствительности к противомикробным препаратам из бактериальных суспензий, полученных из очищенных колоний, для грамположительных и грамотрицательных видов бактерий, соответственно.
Недавно для обнаружения и идентификации бактерий, основанных на каталитической активности (расщепление олигонуклеотидного зонда) бактериальных нуклеаз, была также использована разновидность платформы флуоресцентного детектирования. Однако механизмы трансдукции в этих вариантах были основаны на магнитно-резонансной томографии и иммунохроматографическом анализе.
Благодаря огромному разнообразию нуклеаз и их важной роли в широком спектре бактериальных патогенов, их каталитическая активность может стать многоцелевым диагностическим биомаркером в клинической микробиологии, позволяющим решить некоторые из существующих неудовлетворенных потребностей в различных диагностических приложениях, включая длительное время до постановки диагноза, снижение точности или чрезмерные затраты и сложность. Кроме того, его внедрение в клиническую практику может стимулировать развитие совершенно новых методов, таких как неинвазивная идентификация и визуализация бактерий in vivo.
Любой диагностический метод или анализ сильно ограничен характеристиками биомаркеров, которые они исследуют. Биомаркерами, лежащими в основе всех диагностических иммуноанализов и молекулярно-генетических методов, являются взаимодействия антител с антигеном и генетические детерминанты, соответственно. Таким образом, эти два биомаркера определяют и устанавливают ограничения и недостатки основанных на них анализов, которые включают низкую чувствительность и склонность к интерференции в случае иммуноанализа; или повышенную частоту ложноположительных результатов, неточную информацию о восприимчивости к противомикробным препаратам и высокую сложность в случае молекулярно-генетического анализа.
Недостатки, связанные с этими методами анализа, обусловлены тем, что:
i) генетические детерминанты могут быть обнаружены, даже если патогены уже нежизнеспособны, что приводит к завышению количества положительных результатов. ii) генетические детерминанты устойчивости не являются гарантией фенотипической устойчивости, поскольку устойчивость может зависеть от неизвестных или новых механизмов или от уровня экспрессии генов, что приводит к искажению информации.
iii) большинство молекулярно-генетических методов зависят от очистки/выделения и амплификации целевых детерминант для обеспечения адекватного уровня чувствительности и специфичности. Эти этапы повышают риск перекрестной контаминации образцов и обычно включают в себя множество реагентов и специализированного оборудования, такого как термоциклеры, которые должны быть оптимизированы для работы в различных условиях и матрицах, что повышает сложность и неизбежно влияет на стоимость.
В этом отношении использование нуклеазной активности в качестве биомаркера имеет ряд преимуществ по сравнению с установленными диагностическими биомаркерами в клинической микробиологии, включая генетические детерминанты и взаимодействие антитело-антиген. По сравнению с генетическими детерминантами или взаимодействием антитело-антиген, нуклеазная активность представляет собой фенотипический признак, что позволяет избежать проблем, связанных с корреляцией генотипа и фенотипа. Более того, ее динамическая природа (ферментативная активность) противостоит статической природе гибридизации нуклеиновых кислот или взаимодействия антитело-антиген. Поэтому, независимо от технологии трансдукции, одна нуклеаза может взаимодействовать с более чем одним репортером, выступая в качестве собственного усилителя сигнала. Это не относится к вышеупомянутым аналогам биомаркеров, поскольку репортер может взаимодействовать только с одной конкретной мишенью, полагаясь на дополнительные методы усиления сигнала. Кроме того, как генетические детерминанты, так и взаимодействия антитело-антиген находятся во власти генетической изменчивости (например, мутаций или рекомбинации), что может привести к диагностической резистентности, требующей постоянной валидации целевых биомаркеров.
Нуклеазная активность также уязвима для диагностической резистентности, однако, учитывая некоторые фундаментальные роли нуклеаз в биологии и патогенезе бактерий, вполне вероятно, что их функция, а значит и каталитическая активность, сохраняется, несмотря на возникновение генетических вариаций. Эта гипотеза подкрепляется существованием многочисленных гомологов нуклеаз, наиболее консервативными участками которых являются каталитически активные участки и участки связывания кофакторов. Дополнительным подтверждением служит наблюдение конвергенции функциональных возможностей и каталитической активности негомологичных бактериальных нуклеаз.
Диагностические тесты, использующие нуклеазную активность в качестве биомаркера, уже разработаны и в некоторых случаях применяются в клинической практике для идентификации и характеристики патогенов, таких как S. aureus. С учетом этого, а также в связи с их простой доступностью, различные внеклеточные нуклеазы были предложены в данном обзоре в качестве кандидатов в диагностические маркеры для идентификации и характеристики многочисленных клинически значимых бактериальных патогенов.
Следует отметить, что у некоторых бактериальных патогенов, таких как S. aureus или S. marcescens, существует доминирующая внеклеточная нуклеазная активность известного происхождения и характеристик, которая легко обнаруживается как in vitro, так и in vivo. Однако в других случаях сосуществуют несколько нуклеаз с подобной активностью, как это имеет место у S. pyogenes, C. perfringens или C. jejuni.
Между тем, у других бактериальных патогенов происхождение обнаруженной нуклеазной активности неизвестно. Кроме того, у бактерий, у которых доминирующая нуклеазная активность вырабатывается несекретируемыми нуклеазами, как в случае с периплазматической эндонуклеазой I E. coli, применение диагностики in vivo ограничено. Более того, для диагностики in vitro могут потребоваться дополнительные этапы обработки, такие как лизис бактерий или фракционирование клеток, чтобы получить доступ к их активности, что потенциально влияет на точность и увеличивает сложность и время получения результатов.
По этим причинам для использования всего потенциала нуклеазной активности в качестве диагностического биомаркера в мультинуклеазных средах поэтапный подход к нацеливанию, ограниченный известными и охарактеризованными нуклеазами, является неполноценным. Следовательно, необходима стратегия скрининга, которая может быть направлена на уникальный паттерн нуклеазной активности патогенов, независимо от отдельных нуклеаз, и позволяет выбрать и одновременно оптимизировать чувствительные и специфические диагностические репортеры.
Эти обстоятельства побудили Balian et al. разработать надежную и простую в реализации скрининговую платформу, которая использует преимущества модульности нуклеиновых кислот для итеративного скрининга библиотек олигонуклеотидов с целью отбора субстратов, которые служат высокоспецифичными/селективными репортерами характерных паттернов нуклеазной активности, даже если их этиология неизвестна. В этом контексте состав библиотек будет иметь решающее значение.
Библиотеки, содержащие субстраты различной природы, способные поставить под сомнение каталитические свойства, такие как предпочтение субстрата и последовательности, могут быть оценены стандартным образом для всех патогенов и итеративно перепроектированы и протестированы в раундах скрининга для улучшения таких аспектов, как специфичность и уровень чувствительности. Очевидно, что предыдущие знания о каталитических свойствах характерных нуклеаз или существовании гомологов известных нуклеаз у целевых бактериальных патогенов обязательно помогут в разработке библиотек, но они не являются обязательными. Следует отметить, что использование библиотек нуклеиновых кислот является простым, экономически эффективным и хорошо отработанным по сравнению с библиотеками другой природы (например, пептидами и фагами).
Важно отметить, что скрининговые платформы, подобные описанной Balian et al., могут быть реализованы как in vitro, так и ex vivo или in vivo. При реализации in vitro, после определения матрицы образца (например, сыворотка крови, слюна, мокрота), возможно проведение скрининга различных каталитических параметров, влияющих на ферментативную активность, полученных от различных соответствующих патогенов в отношении выбранных олигонуклеотидов. Параметры, которые можно проверить, включают температуру, уровень pH и присутствие или отсутствие, а также тип, комбинацию и концентрацию кофакторов, хелаторов, ионных соединений, окислительных и восстановительных агентов во время ферментативного процесса.
Таким образом, дополнительные раунды скрининга могут выявить дополнительный набор переменных, влияющих на активность нуклеаз, для дальнейшего определения идеальных условий, позволяющих максимизировать специфичность и чувствительность для уже отобранных репортеров. Можно предположить, что аналогичные скрининговые платформы могут стать основой для разработки диагностических биосенсоров на основе активируемых репортеров, которые, используя благоприятные особенности, связанные с использованием нуклеазной активности в качестве биомаркера, могут обеспечить точную, одно- или мультиплексную идентификацию и характеристику патогенов, даже при полимикробных инфекциях, непосредственно из сложных клинических образцов.
Некоторые из этих возможностей уже продемонстрированы в ряде приложений, начиная от быстрых, простых в применении, специфичных и очень чувствительных тестов для идентификации бактериемии S. aureus непосредственно из положительных культур крови или непосредственно из образцов крови; до количественных фенотипических тестов на чувствительность к противомикробным препаратам для грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые столь же точны, но значительно быстрее, чем классические методы.
Важно отметить, что простота и быстрота, предлагаемые любым из этих методов, уже обещают иметь клиническое значение за счет сокращения времени постановки диагноза (от нескольких дней до нескольких часов), что является важным параметром, влияющим на ведение пациентов, результаты и связанные с этим расходы на здравоохранение. Однако, учитывая обилие и разнообразие нуклеаз в бактериальных патогенах, наличие подходящих скрининговых платформ и достижения в области биосенсинга, разработка новых и усовершенствованных диагностических подходов с использованием нуклеазной активности в качестве биомаркеров для различных клинических и промышленных применений является лишь вопросом времени.
Фактически, даже сейчас нетрудно представить, что некоторые из этих уже известных диагностических подходов могут быть легко адаптированы для аналогичных целей в отношении различных патогенов, просто изменив специфичность репортера таким образом, чтобы он специфически нацеливался на их характерные паттерны нуклеазной активности. Например, подход к скринингу и биосенсингу, использованный Machado et al. для обнаружения S. enterica ser. Typhimurium быстро и точно из образцов свиного мяса для мониторинга безопасности пищевых продуктов, может быть адаптирован для обнаружения других патогенов пищевого происхождения, которые также обладают внеклеточной нуклеазной активностью, таких как C. jejuni или Y. enterocolitica.
Также можно предположить, что подход, использованный Hernandez et al. для специфической идентификации и визуализации инфекций S. aureus in vivo, может быть адаптирован для других патогенов. В случае H. pylori или M. tuberculosis этот подход может быть использован для скрининга, диагностики и мониторинга инфекций, решая при этом проблемы, связанные с существующими подходами, такие как инвазивные диагностические процедуры, трудный сбор образцов и низкая диагностическая чувствительность и специфичность. Однако для применения такого подхода к вышеупомянутым патогенам необходимы новые или оптимизированные методы доставки, а также дальнейшие достижения в технологии трансдукции.
Например, в случае легочных инфекций методы доставки могут использовать концепции, уже изученные в легочной генной терапии, в то время как в случае желудочных инфекций биоразлагаемые жидкие гелеобразные матрицы могут быть использованы в качестве экономически эффективного, клинически применимого средства доставки репортеров к месту инфекции (например, слизистой оболочке желудка), при этом защищая их от неспецифической активации во время процесса. Кроме того, использование активируемых репортеров с применением систем настройки магнитного резонанса, а не системы передачи энергии флуоресценции в ближней инфракрасной области, использованной Hernandez et al., позволило бы обнаруживать и визуализировать глубоко расположенные ткани с помощью клинически доступных систем магнитно-резонансной томографии.
Использование нуклеазной активности в качестве биомаркера не лишено недостатков. Возможно, самым большим ограничением является необходимость существования характерной нуклеазной активности, связанной с конкретным бактериальным патогеном. В некоторых случаях различные виды бактерий могут представлять или экспрессировать один и тот же тип нуклеазы, что может препятствовать диагностической специфичности. Например, как комменсальные, так и патогенные виды Neisseria spp, включая Neisseria meningitidis и N. gonorrhea, обладают полным геном nuc в своих геномах. Однако, если между видами существуют последовательные различия в характере экспрессии этих нуклеаз, они все равно будут выражаться в измеримых и полезных различиях в нуклеазной активности. Типирование штаммов также может оказаться недоступным для анализов, основанных на нуклеазной активности, поскольку штаммовые различия в популяциях нуклеаз у некоторых видов бактерий, таких как Mycoplasma pulmonis, по-видимому, отсутствуют.
Стоит также отметить, что производство нуклеазы может быть подвержено колебаниям, связанным с внутривидовыми вариациями или условиями роста (например, насыщение кислородом или уровень pH). Кроме того, in vivo существует возможность того, что продукция нуклеазы, и, следовательно, активность, может меняться в ходе инфекции в зависимости от функциональной роли данной нуклеазы и связанных с ней регуляторных механизмов. В конечном итоге, эти изменения могут повлиять на чувствительность и специфичность диагностики. Однако, учитывая участие нуклеаз в жизнедеятельности, связанной с вирулентностью, такой как ремоделирование биопленки, уклонение от иммунитета или цитотоксичность хозяина, количественное определение и оценка различий в активности нуклеаз может открыть возможность получения информации, связанной со стадией инфекции или уровнем вирулентности возбудителя. Такая информация может помочь в прогнозировании и терапии.
Однако, вероятно, такой тип оценок будет возможен только в сочетании с методами, способными иметь очень низкие пределы обнаружения и большой динамический диапазон. Низкие пределы обнаружения также желательны in vitro для проведения диагностических оценок непосредственно из сложных клинических образцов, избегая трудоемких этапов обогащения и очистки. Для снижения пределов обнаружения in vitro, обогащение нуклеазы, опосредованное антителами, уже доказало свою эффективность, однако для этого требуется предварительное знание активности нуклеазы, используемой в качестве специфического маркера. Другой вариант включает специфическое ингибирование вездесущих эукариотических нуклеаз, таких как ДНКаза I, для уменьшения возможных источников помех, повышения специфичности и снижения предела обнаружения.
В целом, мы предполагаем, что использование нуклеазной активности в качестве диагностического биомаркера с помощью новых технологических достижений может стать краеугольным камнем в разработке эволюционных и революционных диагностических анализов и методологий, способных дополнить и добавить новые функции к имеющемуся арсеналу диагностических инструментов в клинической микробиологии, удовлетворяя неудовлетворенные потребности и открывая новые пути для скрининга, диагностики и прогноза.
Стоит отметить, что нуклеазы также присутствуют в небактериальных инфекционных агентах, таких как патогенные дрожжи, простейшие и вирусы, в которых они также играют роль в их вирулентности. Фактически, некоторые из этих нуклеаз действуют как факторы вирулентности, способствуя уклонению от иммунитета у патогенных плазмодиальных паразитов или коронавирусов, включая печально известный SARS-Cov-2. Следовательно, использование нуклеазной активности в качестве диагностического биомаркера для небактериальных инфекций также представляет собой привлекательный вариант, который, однако, остается за рамками данного обзора.
