Инфекции кровотока (ИК) - это тяжелые инфекционные заболевания, характеризующиеся проникновением в кровоток различных патогенных микроорганизмов, их размножением, выделением токсинов и продуктов метаболизма, что приводит к системной инфекции, токсемии и системным воспалительным реакциям.
Основными патогенами, вызывающими ИК, являются бактерии, грибки и вирусы, что может привести к бактериемии и сепсису. В тяжелых случаях ИК может вызвать шок, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, мультиорганную недостаточность и даже смерть. Учитывая значительные показатели заболеваемости и смертности, ИК представляет собой серьезную угрозу для жизни и здоровья людей. Поэтому крайне важно найти быстрый и точный метод ранней диагностики ИК, чтобы обеспечить своевременный инфекционный контроль и улучшить показатели выживаемости пациентов.
Идентификация патогена имеет ключевое значение для лечения ИК. Культура крови остается золотым стандартом для этиологической диагностики. Однако на частоту положительных результатов посева крови влияют различные факторы, включая время взятия крови, объем крови, тип и количество флаконов для посева крови, а также условия культивирования. Кроме того, культура крови - это длительный процесс, обычно требующий 2-5 дней для идентификации возбудителя и проведения анализа на чувствительность к противомикробным препаратам (АSТ), что не способствует ранней клинической терапии.
Исследователи стремятся разработать простые, быстрые и точные методы этиологической диагностики, изучая новые подходы к обнаружению патогенов, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), технология ДНК-чипов, масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) и секвенирование следующего поколения (NGS). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения. Например, ПЦР и технология ДНК-чипов имеют ограниченное клиническое применение из-за низкой чувствительности при выявлении смешанных бактериальных инфекций. На результаты MALDI-TOF MS могут влиять такие факторы, как культуральная среда и наличие эритроцитов, а точность зависит от полноты известных баз данных. Аналогичным образом, NGS имеет относительно небольшую длину считывания, сталкивается с проблемами при анализе сложных структур микробных геномов, а оборудование для NGS связано с высокой стоимостью. Напротив, быстрое развитие технологии нанопорового секвенирования (NST) позволило эффективно решить многие из этих проблем. Данная статья посвящена применению NST для быстрой этиологической диагностики ИК и определения степени резистентности к противомикробным препаратам.
Принципы и преимущества NST
NST - это метод, который предполагает секвенирование отдельных молекул ДНК без использования ПЦР. Двухцепочечная ДНК расплетается геликазой на отдельные нити, а возникающие при этом электрические сигналы собираются и обрабатываются для распознавания специфических оснований, когда отдельные нити протягиваются через сеть белковых нанопор. В 2014 году компания Oxford Nanopore Technologies представила платформу для секвенирования MinION, основным компонентом которой являются белковые нанопоры. Нанопоры, состоящие из множества белков, встраиваются в тонкую пленку с высоким сопротивлением, образуя канал в мембране. При подаче трансмембранного напряжения различные основания ДНК генерируют различные колебания ионного потока при прохождении через нанопоры. Анализируя пиковые значения этих колебаний ионного потока, можно идентифицировать соответствующие основания, что позволяет проводить высокоскоростное секвенирование в режиме реального времени.
По сравнению с NGS, NST обладает рядом преимуществ. Во-первых, NST отличается высокой скоростью секвенирования. Проточная кювета MinION содержит 512 каналов с 4 нанопорами в каждом канале, всего для секвенирования используется 2 048 нанопор. Скорость прохождения оснований через нанопоры может достигать 450 п.н./сек, а производительность одной проточной кюветы - примерно 10-15 Гб за 24 часа.
Во-вторых, NST производит сверхдлинные чтения. Средняя длина считывания, генерируемого нанопоровым секвенатором, обычно превышает 500 п.н., а максимальная длина считывания достигает 2,273 Мб. Кроме того, некоторые исследователи предполагают, что длина чтения нанопорового секвенатора зависит от длины входных фрагментов ДНК. Jain et al. с помощью моделирования предсказали, что, помимо физических сил, вызывающих разрыв ДНК в растворе, нанопоровое секвенирование может не иметь внутренних ограничений на длину считывания, что позволит проводить всесторонний анализ сложной структуры генома микроорганизмов.
В-третьих, NST позволяет проводить секвенирование в режиме реального времени. Например, платформа для секвенирования MinION обрабатывает считывания по мере их генерации, сокращая время секвенирования до нескольких часов или даже до 1 ч., что способствует ранней и быстрой постановке клинического диагноза.
В-четвертых, NST позволяет проводить секвенирование отдельных молекул. В отличие от NGS, нанопоровое секвенирование не опирается на усиление сигнала с помощью ПЦР, что позволяет напрямую обнаруживать ДНК или РНК в образцах на уровне одной молекулы и избегать погрешностей, вносимых NGS при амплификации и подготовке библиотек. Кроме того, можно напрямую собирать геномы РНК-вирусов и одновременно определять метилирование РНК.
Наконец, NST удобна и экономически эффективна. Например, секвенатор MinION портативен, размером с USB-накопитель, стоит около 1000 долларов США и имеет низкую стоимость одного прогона, что делает его очень подходящим для клинических применений. Эти особенности и преимущества позволяют беспрепятственно внедрять NST в клиническую диагностику, лечение и научные исследования.
Применение NST для диагностики возбудителей ИК
Быстрое выявление возбудителей ИК
NST имеет большое прикладное значение для быстрой диагностики широкого спектра патогенов, вызывающих инфекции, включая инфекции дыхательных путей, пищеварительной системы, мочевыделительной системы, центральной нервной системы и системы кровообращения. Например, Hong et al. оценили диагностическую эффективность NST при исследовании 202 образцов крови пациентов с гематологическими заболеваниями и в общей сложности было выявлено 56 патогенов, включая бактерии, грибки и вирусы. Для проверки точности NST был использован метод Сэнгера, и результаты показали, что по сравнению с комбинацией культуры крови и ПЦР, клиническая чувствительность и специфичность которых составляли 66,67% и 40,11% соответственно, NST продемонстрировала значительно более высокую чувствительность и специфичность - 92,11% и 78,41% соответственно. Кроме того, время от взятия образца до получения окончательного заключения по нанопоровому секвенированию составило менее 24 ч, а время предварительного заключения для экстренных случаев сократилось до <6 ч. Таким образом, NST обладает многообещающим потенциалом для быстрого выявления патогенов широкого спектра действия при ИК.
Кроме того, исследователи подтвердили точность и своевременность NST в выявлении различных возбудителей ИК. Ashikawa et al. использовали платформу MinION для секвенирования ампликонов 16S рРНК/ITS 11 видов бактериальных штаммов и 5 видов Candida, полученных из культур крови, и успешно идентифицировали патогены в течение примерно 10 минут после начала нанопорового секвенирования. За исключением одного штамма Streptococcus pyogenes и Escherichia coli, результаты секвенирования в первые 10 мин и через 48 ч совпадали с данными, полученными с помощью MALDI-TOF MS. Для дальнейшего подтверждения эффективности MinION был использован метод Сэнгера, который показал средний уровень идентичности последовательностей 99,03% в первые 10 минут и 99,22% через 48 часов для всех 20 образцов. Эти результаты указывают на то, что чтения, полученные в течение первых 10 минут секвенирования, достаточны для идентификации патогенов. Этот результат демонстрирует, что нанопоровое секвенирование может быстро и точно выявлять распространенные бактериальные и грибковые патогены.
Помимо выявления распространенных патогенов, нанопоровое секвенирование демонстрирует преимущества в идентификации вирусов и редких и привередливых бактерий. Greninger et al. использовали нанопоровое секвенирование MinION в сочетании с недавно разработанной системой биоинформатики MatePORE для биоинформатического анализа в режиме реального времени четырех образцов крови от инфицированных вирусами пациентов, добившись времени от образца до обнаружения менее 6 ч. При титрах 107-108 копий/мл считывания к вирусу Эбола от двух пациентов с острой геморрагической лихорадкой и вирусу чикунгунья от бессимптомного донора крови были обнаружены в течение 4-10 мин после сбора данных, а более низкий титр вируса гепатита С (1 × 105 копий/мл) был обнаружен в течение 40 мин.
Bialasiewicz et al. с помощью нанопорового секвенирования обнаружили Capnocytophaga canimorsus в цельной крови пациента, укушенного собакой, всего за 19 ч, в то время как культура крови пациента оставалась отрицательной даже через 3 дня.
Wang et al. сообщили о случае, когда у пациента, перенесшего аллогенную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток, развились диарея и лихорадка примерно через 3 месяца после трансплантации. Через 10 дней в культуре крови выросли грамотрицательные бациллы. Положительные культуры крови были перенесены на чашки кровяного агара для дальнейшего культивирования, но культуры не дали результатов, и обнаружение методом MALDI-TOF MS также было безуспешным. Тогда исследователи выделили ДНК из положительных культур крови и провели нанопоровое секвенирование, в результате чего в течение 1 ч была успешно идентифицирована Legionella pneumophila подвида fraseri. В итоге инфекция была взята под контроль путем корректировки схемы приема антибиотиков пациентом. Эти результаты подчеркивают потенциал нанопорового секвенирования в быстрой идентификации вирусов и редких патогенов, оптимизации использования антибиотиков и улучшении прогноза у пациентов с ИК.
Выявление лекарственной резистентности и генов резистентности у патогенов
Нанопоровое секвенирование позволяет проводить не только секвенирование в режиме реального времени, но и полное секвенирование генома патогенов, что дает дополнительную информацию, например, информацию о генах лекарственной устойчивости, и помогает врачам в выборе подходящих антибиотиков и планов лечения. В проспективном обсервационном многоцентровом исследовании, проведенном в Австралии, 52 положительных образца крови от пациентов с клиническими признаками сепсиса были секвенированы с помощью платформы MinION для оценки эффективности NSТ в идентификации патогенов и прогнозировании чувствительности к антимикробным препаратам.
Результаты показали, что в положительных бульонах для посева крови было идентифицировано 27 видов грамположительных бактерий и 23 вида грамотрицательных бактерий, причем в 2 образцах присутствовали полимикробные инфекции. По сравнению с традиционными методами, соответствие секвенированных образцов на уровне видов составило 94,2% (49/52), а точность определения отдельных бактерий достигала 98% (49/50). Среди 24 образцов, доступных для прогнозирования AST на основе высококачественного секвенирования, общая согласованность результатов 262 AST составила 89,3%. Эти результаты свидетельствуют о том, что нанопоровое секвенирование обеспечивает высокую точность идентификации видов и прогнозирования AST.
Кроме того, Liu et al. сравнили идентификацию видов патогенов и выявление генов лекарственной устойчивости с помощью нанопорового секвенирования с традиционными методами. Результаты секвенирования 37 положительных штаммов, выделенных из культур крови, совпали с результатами MALDI-TOF MS. В связи с выпиской или летальным исходом некоторых пациентов исследование AST было проведено для 32 из 37 образцов. Нанопоровое секвенирование было проведено для 3 штаммов Staphylococcus aureus, 10 штаммов E. coli и 7 штаммов Klebsiella pneumoniae со стандартными фенотипами AST. Несколько генов устойчивости к противомикробным препаратам (AMR), соответствующих фенотипам устойчивости, были обнаружены у всех трех типов штаммов. Например, у E. coli и K. pneumoniae были обнаружены гены tet(A), ассоциированный с резистентностью к тетрациклину, и dfrA, ассоциированный с резистентностью к триметоприму-сульфаметоксазолу. S. aureus несла ermA, который связан с резистентностью к линкозамидам и макролидам. Кроме того, K. pneumoniae несла гены blaKPC-2 (кодирующий сериновую карбапенемазу) и blaNDM-5 (кодирующий металло-β-лактамазу), которые ассоциируются с резистентностью к карбапенемам. Однако некоторые гены AMR, такие как ANT(9)-Ia, который ассоциируется с резистентностью к аминогликозидам у S. aureus, не показали подтвержденной связи с фенотипической AMR. Хотя профиль генов AMR не всегда коррелирует с фенотипом резистентности, точное определение этих взаимосвязей может улучшить результаты антимикробной терапии, оптимизировать персонализированные схемы лечения и повысить показатели излечения и выживаемости у пациентов с ИК.
Анализ геномных характеристик и генетического фона патогенов
Повторяющиеся последовательности и плазмиды микробных геномов часто содержат важнейшую генетическую информацию, связанную с лекарственной резистентностью. Нанопоровое секвенирование с его сверхдлинными чтениями позволяет не только собирать полные структуры бактериальных хромосом, но и точно определять сложные острова генов множественной лекарственной устойчивости (MDR) на бактериальных хромосомах и структуру плазмид MDR, переносимых бактериями.
Например, Ashton et al. использовали нанопоровое секвенирование с длинным прочтением на платформе MinION в сочетании с данными секвенирования с коротким прочтением для гибридной сборки, чтобы успешно идентифицировать сложный остров генов лекарственной резистентности, вставленный в хромосому Salmonella, и подтвердили точность экспериментальной проверки.
Аналогичным образом, Li et al. выделили штамм O139 Vibrio cholerae из крови пациента с бактериемией и получили полную последовательность его генома с помощью нанопорового секвенирования. Этот штамм содержал 15 генов лекарственной резистентности, причем два острова резистентности несли инсерции IS26, способные захватывать и экспрессировать чужеродные гены. Кроме того, штамм содержал плазмиду IncA/C длиной 172 914 п.н. - лекарственно-устойчивую плазмиду, обладающую высокой способностью накапливать гены резистентности к антибиотикам, что делало штамм резистентным к множеству антибиотиков и позволяло напрямую передавать гены резистентности путем рекомбинации с другими плазмидами.
Tian et al. выделили карбапенем-резистентный штамм K. pneumoniae из крови пациента с ИК, осложненным абсцессом печени. Полногеномное секвенирование (WGS), проведенное с помощью платформ Illumina и MinION, показало, что штамм содержал одну циркулярную хромосому и девять плазмид. Кодирующий карбапенемазу ген blaOXA-232 располагался в репликоне ColKP3 длиной 6 141 п.н., фланкированном ΔISEcp1 и ΔlysR-ΔereA, в то время как blaCTX-M-15 находился на хромосоме, опосредованной транспозоном Tn2012 на основе ISEcp1. Кроме того, штамм нес rmpA2-ассоциированную pLVPK-подобную плазмиду вирулентности с одним кластером генов iutA-iucABCD и IS26-опосредованную плазмиду слияния MDR. Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе лекарственной резистентности, и динамических процессов передачи резистентности. Они имеют большое значение для профилактики и контроля лекарственной резистентности и разработки новых антибиотиков.
Нанопоровое секвенирование обладает многочисленными преимуществами для диагностики клинических инфекционных заболеваний. Оно позволяет быстро и точно выявлять возбудителей ИК, анализировать гены резистентности и геномные характеристики, а также устранять ограничения традиционных методов этиологической диагностики и NGS, обладая большим потенциалом для оптимизации клинических процедур диагностики ИК. Кроме того, NST использует богатую информацию, полученную с помощью данных WGS, для более точного определения молекулярных механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости и передачи резистентности. Это вносит существенный вклад в профилактику и контроль распространения лекарственно-устойчивых бактерий, а также предлагает новые пути и идеи для разработки антибиотиков.
Однако у NST есть свои ограничения. Во-первых, частота ошибок, связанных с нанопоровым секвенированием, может достигать 5-15%, что значительно выше, чем у NGS - 0,1-1%. Высокая частота ошибок является основным недостатком NST, поскольку потенциально может привести к неправильной идентификации патогенов со схожими геномными последовательностями. Поэтому исследователи работают над применением методов подготовки библиотек 2D и 1D2, позволяющих проводить повторное секвенирование фрагментов ДНК, что повышает точность нанопорового секвенирования.
Во-вторых, нанопоровое секвенирование подвержено интерференции со стороны генома хозяина или других фоновых элементов, что накладывает жесткие требования к качеству образца и количеству нуклеиновых кислот. Для повышения чувствительности детекции необходима предварительная обработка, например, очистка или направленное обогащение микробных нуклеиновых кислот.
И наконец, хотя стоимость одного цикла NST относительно невелика, производительность секвенирования ниже, чем у NGS. Следовательно, получение того же объема данных приводит к увеличению операционных затрат на нанопоровое секвенирование, что ограничивает его широкое применение.
В настоящее время интеграция преимуществ NST и NGS может более эффективно решить проблемы, возникающие как в клинической практике, так и в научных исследованиях.
