Совершенствование методов обнаружения малых РНК в образцах кала открывает путь к созданию новых, неинвазивных биомаркеров для мониторинга здоровья кишечника.
Кишечник млекопитающих - это оживленное место, где происходит пищеварение, иммунный контроль и взаимодействие хозяина с микроорганизмами. Кишечные микроРНК - маленькие некодирующие молекулы, регулирующие экспрессию генов, участвуют во многих из этих процессов. Эти микроРНК можно обнаружить в кале, что дает возможность неинвазивного исследования здоровья кишечника.
Увлеченная большим влиянием этих маленьких молекул, микробиолог Эмма Лейтон решила изучить фекальные микроРНК в рамках своей аспирантуры в Манчестерском университете. Однако она столкнулась с некоторыми трудностями. Никто еще не сказал: «Вот как нужно выделять РНК из образцов фекалий» или «Вот лучший способ создания библиотек для секвенирования малых РНК», - рассказывает Лейтон.
Чтобы устранить этот пробел, Лейтон и ее коллеги недавно оптимизировали систему обнаружения фекальных микроРНК и продемонстрировали ее способность профилировать молекулы в образцах кала мышей. Результаты исследования, опубликованные в журнале Nature Communications, обеспечивают надежную основу для выделения и секвенирования фекальных микроРНК, которые могут служить биомаркерами таких заболеваний, как рак. «Я нахожу [это исследование] очень интересным, - считает Алессио Наккарати, молекулярный эпидемиолог, изучающий фекальные миРНК в Итальянском институте геномной медицины (IIGM), который не принимал участия в исследовании. По его словам, эта работа может иметь важные последствия для диагностики.
Ранее исследователи выделяли и секвенировали микроРНК, используя различные методы. Чтобы стандартизировать процедуру, Лейтон и ее коллеги протестировали и откорректировали различные части этих протоколов. Они определили идеальную температуру хранения фекальных гранул для получения высококачественной РНК и параметры ПЦР для создания подходящей библиотеки кДНК для секвенирования РНК. По сравнению с тремя другими широко используемыми методами, их метод позволил получить наибольшее количество прочтений микроРНК и большее количество видов микроРНК. «Когда я увидела, что мы действительно повысили эффективность и получили наибольшее количество прочтений микроРНК, я была удивлена и очень, очень счастлива», - поделилась Лейтон.
Вооружившись оптимизированным протоколом, Лейтон и ее сотрудники оценили его эффективность для профилирования микроРНК, экспрессируемых при кишечных инфекциях. Они заразили мышей кишечным паразитом Trichuris muris и профилировали микроРНК их фекалий. По сравнению с контрольными животными инфицированные мыши экспрессировали более высокие уровни трех микроРНК, включая miR-200c, и более низкие уровни четырех, включая miR-29a. Определение предполагаемых целей этих микроРНК показало, что молекулы могут потенциально влиять на фиброз, когда чрезмерное производство коллагена фибробластами приводит к образованию рубцов. Другие заболевания, такие как воспалительные заболевания кишечника, вызывают подобное рубцевание, что открывает возможность использования микроРНК в качестве биомаркеров фиброза.
Чтобы изучить роль этих микроРНК в развитии фиброза, исследователи обрабатывали культивируемые фибробласты молекулами, имитирующими или ингибирующими эти микроРНК. Фибробласты, подвергшиеся воздействию ингибитора miR-29a, вырабатывали больше коллагена, что указывает на то, что снижение уровня miR-29a после паразитарной инфекции способствовало отложению коллагена и развитию фиброза. И наоборот, добавление имитатора miR-200c увеличивало выработку коллагена в фибробластах, что соответствует более высокому уровню miR-200c после заражения, способствующему фиброзу.
Наконец, Лейтон и ее коллеги проверили это наблюдение in vivo, изучив патологию тканей кишечника контрольных и зараженных T. muris мышей. У последних они обнаружили обширный фиброз, а также большее количество микроРНК, связанных с фиброзом, что подтвердило их предположение о том, что эти малые РНК участвуют в фиброзе, вызванном инфекцией. По словам Лейтон, получение результатов in vivo стало хорошим подтверждением потенциала метода в определении биомаркеров заболеваний. «То, что им удалось продемонстрировать, что [изменения, связанные с инфекцией] связаны с микроРНК, вероятно, является наиболее важным и новым моментом», - отметил Наккарати. Дополнительные исследования в различных условиях могут помочь ученым лучше понять, насколько хорошо этот протокол работает для выявления биомаркеров заболеваний, добавил он.
По мнению Барбары Пардини, молекулярного эпидемиолога, изучающего фекальные миРНК в IIGM, которая не принимала участия в исследовании, авторы «очень хорошо описали концепцию». «Но с другой стороны, это может оказаться дорогостоящим». Лейтон говорит, что в будущем можно будет сконцентрироваться на том, чтобы сделать этот конвейер высокопроизводительным и более экономичным. «Я думаю, что можно еще многое оптимизировать в самой методике, и надеюсь, что эта небольшая работа поможет в этом».
