Расширяя генетический алфавит
Биологи-синтетики перепрофилировали редко используемые кодоны, чтобы встраивать в белки новые аминокислоты и расширять возможности белковой инженерии.
Живые организмы синтезируют ошеломляющее разнообразие белков, соединяя 20 аминокислот в цепочки любой длины и порядка. В прошлом, чтобы расширить разнообразие белков за пределы этих 20 субъединиц, ученые настраивали генетический код и создавали искусственные белки, содержащие нетрадиционные аминокислоты. Однако эти усилия приносили минимальный успех, поскольку клетки включали дополнительные строительные блоки лишь в несколько копий желаемых белков.
В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Science, биологи-синтетики разработали альтернативную стратегию включения новых аминокислот в белки. Эти результаты дают новый метод создания белков с искусственными свойствами с высокой производительностью, расширяя сферу применения синтетической биологии. «Эта группа проделала огромную работу и смогла добиться эффективности выше 80%, что, на мой взгляд, говорит о том, что они действительно выложились по полной», - считает Джеймс Ван Девентер, белковый инженер из Университета Тафтса, который не принимал участия в исследовании.
Рибосомы получают инструкции по синтезу белков от генов в виде транскрипта РНК, в котором указан порядок расположения 20 аминокислот. Однако РНК состоит только из четырех букв: аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и урацила (U). Чтобы эти четыре основания могли кодировать 20 аминокислот, рибосома считывает их в виде триплетов, называемых кодонами, которых существует 64 разновидности. Чтобы добавить аминокислоты в растущую белковую цепь, кодоны привлекают к рибосоме трансферную РНК (тРНК). Каждая тРНК распознает определенную последовательность кодонов и доставляет соответствующую аминокислоту в зарождающийся белок. Три из 64 кодонов сигнализируют о завершении синтеза белка. Эти стоп-кодоны не соединяются с тРНК и дают рибосоме указание освободить полипептидную цепь.
В предыдущих попытках расширить алфавит генетического кода исследователи вводили в клетки тРНК, связанную с неканонической аминокислотой и распознающую стоп-кодон. Однако эта стратегия оказалась неэффективной, поскольку белки, запускающие окончание синтеза белка, связывались с кодоном сильнее, чем модифицированная тРНК, поэтому стоп-кодоны большую часть времени сохраняли свою естественную функцию. «Эффективность обычно ниже 5%, поэтому в этом случае вы редко можете делать приложения на ее основе», - комментирует Шиксиан Лин, биолог-синтетик из Чжэцзянского университета и соавтор исследования. Лин предположил, что более эффективным может быть предоставление клеткам тРНК, которая работает в паре с редким кодоном. Для редких кодонов клетка производит меньше соответствующих тРНК и синтетические тРНК испытывают меньшую конкуренцию.
Сначала группе Лина пришлось искать редкие кодоны в линиях человеческих клеток. С помощью секвенирования РНК они зафиксировали семь наименее распространенных триплетов. Чтобы определить, какой из семи наиболее эффективен, они ввели каждый из редких кодонов в ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) и перенесли модифицированную конструкцию в клетки. Когда они обработали культуры синтетической тРНК, несущей легко отслеживаемую нетрадиционную аминокислоту и распознающую эти редкие кодоны, то обнаружили, что триплет TCG вводит новый строительный блок в белок с наибольшей эффективностью.
Учитывая, что кодон TCG может эффективно инструктировать рибосому добавить нетрадиционную аминокислоту в нужный белок, ученые предположили, что она также может добавить новую субъединицу к другим белкам в клетке, которые несут этот редкий триплет, потенциально изменяя функцию важных факторов. Чтобы оценить уровень фонового включения, исследователи обрабатывали клетки различными тРНК, которые несли отслеживаемую аминокислоту и распознавали либо кодон TCG, либо один из шести других наименее используемых кодонов. Собрав все белки из клеток и окрасив их на наличие отслеживаемого строительного блока, исследователи обнаружили, что клетки, обработанные тРНК, соответствующей кодону TCG, дают самый слабый сигнал, что свидетельствует о том, что этот триплет приводит к самому низкому уровню фонового включения в другие белки.
Чтобы понять, почему замена кодона TCG минимально влияет на другие белки в клетке, группа Лина изучила последовательности РНК по обе стороны от кодона TCG. Они обнаружили, что эффективность встраивания зависит от окружающих последовательностей. «Мы даже обнаружили, что если кодон выше по цепочке мутирует на один SNP (однонуклеотидный полиморфизм), то эффективность перекодировки будет кардинально отличаться», - рассказал Лин. Это означает, что исследователи, желающие перепрофилировать этот кодон, должны тщательно продумать, где его разместить в последовательности. «В некоторых случаях мы включаем эти редкие кодоны в разные позиции белка и эффективность перекодировки резко меняется от 5 до 99%», - отметил он.
Наконец, чтобы расширить границы своей стратегии, биологи-синтетики попытались перепрофилировать два следующих наименее используемых кодона, TAG и TGA, наряду с TCG. Они успешно модифицировали eGFP так, чтобы он нес в своей цепи одновременно три нетрадиционные аминокислоты. Это открытие показывает, что в белки можно добавлять множество новых субъединиц с уникальными свойствами, что расширяет возможности исследователей по конструированию биомолекул со сложными функциями.
Инженерия белков, способных переносить нетрадиционные аминокислоты, может найти терапевтическое применение. Ван Девентер предположил, что ученые могут использовать эту стратегию для установки аминокислоты, которая действует как конъюгат с лекарством, на антитела. Заставив клетку включить конъюгат в процессе синтеза белка, можно повысить выход продукции по сравнению с химическим изменением готовых антител, пояснил он.
Исследователи также могут использовать эту стратегию для добавления в белки строительных блоков с необычными свойствами. «Мы стараемся включать в белки неестественные аминокислоты с высокой химической реактивностью", - пояснил Лин. Это может позволить новой аминокислоте подвергаться дальнейшим модификациям после синтеза белка. Например, такой подход может позволить исследователям включать в белки сшиваемые аминокислоты, заставляя их физически соединяться, отметил Ван Девентер. Такая технология может облегчить изучение физических взаимодействий между белками.
