РНК-революция
Ученые недавно обнаружили тысячи активных молекул РНК, которые могут управлять человеческим организмом.
Томас Джинджерас вовсе не собирался перевернуть основные представления о том, как устроено человеческое тело. В 2012 году он, генетик, работающий в лаборатории Колд-Спринг-Харбор в штате Нью-Йорк, был одним из нескольких сотен ученых, которые просто пытались составить каталог функций ДНК человека. Их проект назывался ENCODE, то есть «Энциклопедия элементов ДНК». Примерно за десять лет до этого были идентифицированы почти все три миллиарда строительных блоков ДНК, из которых состоит геном человека. Джинджерас и другие ученые ENCODE пытались выяснить, что делает вся эта ДНК.
Большинство биологов в то время полагали, что большая ее часть ничего особенного не делает. По оценкам первых составителей карты генома, от 1 до 2% нашей ДНК составляли гены в классическом понимании: участки генома, кодирующие белки - рабочие лошадки человеческого тела, которые переносят кислород к различным органам, строят сердечные мышцы и клетки мозга, а также делают практически все остальное, что необходимо людям для поддержания жизни. Считалось, что основной задачей генома является производство белков. Для этого гены записывают производственные инструкции в молекулы-мессенджеры, называемые мРНК, которые, в свою очередь, отправляются в белковые фабрики клетки. Чем же является остальная часть ДНК генома? По словам Джинджераса, «регионы, кодирующие белки», были предположительно «окружены целым океаном биологически нефункциональных последовательностей». Другими словами, это была в основном мусорная ДНК.
Поэтому для него и остальных членов группы ENCODE стало большим прорывом, когда в нескольких статьях, опубликованных в 2012 году в журнале Nature, он и его коллеги сообщили, что в то или иное время не менее 75% генома транскрибируется в РНК. Работа ENCODE, в которой использовались методы, позволяющие картировать активность РНК на участках генома, началась в 2003 году, а в 2007 году были получены предварительные результаты. Но только через пять лет стали понятны масштабы этой транскрипции. Если только 1-2% этой РНК кодировали белки, то для чего же предназначалась остальная часть? Некоторые из них, как знали ученые, выполняли важнейшие задачи, такие как включение или выключение генов; многие другие функции еще не были выяснены. Тем не менее никто не предполагал, что три четверти нашей ДНК превращается в РНК, не говоря уже о том, что такое ее количество может быть полезным.
Некоторые биологи встретили это заявление со скептицизмом, граничащим с возмущением. Команду ENCODE обвинили в том, что она преувеличивает свои результаты; некоторые критики утверждали, что большая часть РНК была получена случайно, потому что фермент, производящий РНК, который путешествует по геному, довольно неразборчив в выборе участков ДНК, которые он считывает.
Теперь выясняется, что похоже ENCODE была по сути права. Десятки других исследовательских групп, изучающих активность генома человека, также обнаружили, что большая часть нашей ДНК производит «некодирующую» РНК. Она не кодирует белки, как мРНК, а взаимодействует с другими молекулами для выполнения тех или иных биохимических задач. К 2020 году в рамках проекта ENCODE было выявлено около 37 600 некодирующих генов - участков ДНК, содержащих инструкции для молекул РНК, которые не кодируют белки. Это почти в два раза больше, чем генов, кодирующих белки. Другие данные сильно разнятся: от 18 000 до почти 96 000. Есть еще сомневающиеся, но есть и биологи-энтузиасты, такие как Жанна Лоуренс и Лиза Холл из Медицинской школы Массачусетского университета. В комментарии к журналу Science за 2024 год они назвали эти открытия частью «РНК-революции».
Революционным эти открытия делает выяснение того, что же конкретно выполняет вся эта некодирующая РНК, сокращенно называемая нкРНК. Большая ее часть, похоже, участвует в регуляции генов: не просто выключает или включает их, но и точно настраивает их активность. Таким образом, хотя в некоторых генах заложены белки, нкРНК может контролировать активность этих генов и, таким образом, в конечном итоге определять, будут ли созданы их белки. Это сильно расходится с основной концепцией биологии, сложившейся после открытия двойной спирали ДНК около 70 лет назад, согласно которой ДНК создает белки.
«Похоже, мы в корне неверно понимаем природу генетического программирования»,
- написали молекулярные биологи Кевин Моррис из Квинслендского технологического университета и Джон Маттик из Университета Нового Южного Уэльса в Австралии в статье 2014 года.
Еще одно важное открытие заключается в том, что некоторые нкРНК, по-видимому, играют роль в развитии заболеваний, например, регулируют клеточные процессы, связанные с некоторыми формами рака. Поэтому ученые выясняют, можно ли разработать препараты, нацеленные на такие нкРНК, или, наоборот, использовать сами нкРНК в качестве лекарств. Например, если ген кодирует белок, который помогает раковой клетке расти, то нкРНК, которая отключает этот ген, может помочь в лечении рака.
Несколько некодирующих РНК были известны уже много десятилетий, но они, похоже, играли какую-то роль в производстве белков. Например, всего через несколько лет после того, как Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон и несколько их коллег выяснили структуру ДНК, исследователи обнаружили, что некоторые РНК, называемые трансферными, цепляются за аминокислоты, которые в итоге соединяются в белки.
Однако в 1990-х годах ученые поняли, что нкРНК могут делать вещи, совершенно не связанные со строительством белков. Эти новые роли стали известны благодаря попыткам понять процесс Х-инактивации, когда одна из двух Х-хромосом, носителями которых являются женщины, замолкает, и все 1000 или около того ее генов (у человека) оказываются выключенными. Этот процесс, как оказалось, контролируется геном под названием XIST. Но попытки найти соответствующий белок XIST неизменно заканчивались неудачей.
Оказалось, что ген работает не через белок, а вырабатывает длинную некодирующую молекулу РНК (lnc - long non-coding RNA). Такие РНК обычно длиннее примерно 200 нуклеотидов, которые являются химическими строительными блоками ДНК и РНК. Используя метод микроскопии, называемый флуоресцентной гибридизацией in situ, Лоуренс и ее коллеги показали, что эта РНК оборачивается вокруг одной Х-хромосомы (выбранной случайным образом в каждой клетке), вызывая стойкие изменения, которые заставляют гены молчать. «Это было первое доказательство того, что лнкРНК что-то делает», - говорит Лоуренс, - «и это было совершенно неожиданно».
Если некодирующие РНК влияют на то, как клетка обрабатывает генетическую информацию, возможно, их можно использовать в медицине. Однако XIST не так уж необычен в создании нкРНК. В начале 2000-х годов стало ясно, что транскрипция некодирующих последовательностей ДНК широко распространена. Например, в 2002 году группа специалистов биотехнологической компании Affymetrix под руководством Джинджераса, который в то время работал там же, сообщила, что транскрибируется гораздо большая часть хромосом 21 и 22 человека, чем только белково-кодирующие регионы.
Однако только после того, как в 2012 году ENCODE опубликовала свои результаты, нкРНК стало невозможно игнорировать. По признанию Петера Штадлера, эксперта по биоинформатике из Лейпцигского университета (Германия), антипатия к этим находкам отчасти объясняется тем, что они казались нежелательным и ненужным усложнением. «Биологическое сообщество считало, что мы уже знаем, как работает клетка, и поэтому открытие [нкРНК] было скорее раздражающим фактором, - говорит он. Более того, оно показало, что простейшие организмы не всегда являются надежным ориентиром для биологии человека: в бактериях гораздо меньше нкРНК, изучение которых долгое время определяло представления о том, как регулируются гены.
Но сейчас уже невозможно повернуть ход событий вспять: было обнаружено много тысяч человеческих нкРНК и Маттик предполагает, что их реальное число превышает 500 000. Однако лишь некоторые из них обладают специфическими функциями, а сколько их на самом деле, остается открытым вопросом. «Лично я не думаю, что все эти РНК играют какую-то индивидуальную роль, - рассуждает Лоуренс. "Однако некоторые из них могут действовать в группах, регулируя другие молекулы».
Как именно лнкРНК осуществляют такую регуляцию, также остается предметом споров. Одна из идей заключается в том, что они помогают формировать так называемые конденсаты: плотные жидкие сгустки, содержащие целый ряд различных регуляторных молекул. Считается, что конденсаты удерживают всех соответствующих игроков в одном месте достаточно долго, чтобы они могли коллективно выполнять свою работу. Другая идея заключается в том, что лнкРНК влияют на структуру хроматина - комбинации ДНК и белков, из которых состоят волокна хромосом в клеточном ядре. Структура хроматина определяет, какие из его генов доступны и могут быть транскрибированы; если участки хроматина слишком плотно упакованы, ферментный механизм транскрипции не может добраться до них. «Некоторые лнкРНК, по-видимому, связаны с хроматин-модифицирующими комплексами, - считает Марсель Дингер, исследователь геномики из Сиднейского университета.
Если только 1-2% РНК из нашего генома кодируют белки, то для чего же предназначено остальное? Некоторые, как знали ученые, выполняют важнейшие задачи, например, включают или выключают гены. Лоуренс и Холл предполагают, что лнкРНК могут служить основой для организации других молекул, например, удерживая некоторые из многих сотен РНК-связывающих белков в функциональных узлах. Одна из лнкРНК под названием NEAT1, которая участвует в формировании небольших отсеков в ядре, называемых параспекулами, как было показано, способна связывать до 60 таких белков. Или же такие РНК-скэффолдинги могут организовывать сам хроматин в определенные структуры и таким образом влиять на регуляцию генов.
Такие РНК могут иметь регулярно повторяющиеся модули и, соответственно, повторяющиеся последовательности - особенность, которая долгое время считалась отличительной чертой ненужной ДНК, но в последнее время оказывается, что она не такая уж и ненужная. В пользу такого взгляда на лнкРНК как на строительные леса говорит опубликованный в 2024 году доклад о богатых повторами нкРНК в клетках мозга мышей, которые сохраняются по крайней мере в течение двух лет. Исследование, проведенное Сарой Зохер из Немецкого центра нейродегенеративных заболеваний в Дрездене и ее коллегами, показало, что эти нкРНК необходимы для поддержания частей хроматина в компактном и молчаливом состоянии. Эти нкРНК - лишь одна из ветвей семейства некодирующих РНК, и биологи продолжают открывать другие, которые, по-видимому, выполняют различные функции и по-разному влияют на то, что происходит с клеткой и, следовательно, со всем человеческим организмом.
Некоторые из этих РНК вовсе не длинные, а удивительно короткие. Их история началась в 1980-х годах, когда Виктор Амброс, работая в качестве постдокторанта в Массачусетском технологическом институте, изучал ген lin-4 у червя Caenorhabditis elegans. Мутации lin-4 вызывали дефекты развития, при которых «клетки повторяли целые программы развития, которые они должны были прервать», - рассказывает Амброс. Казалось, что lin-4 может быть своего рода «главным регулятором», контролирующим хронологию различных стадий развития. «Мы думали, что lin-4 - это ген, кодирующий белок», - говорит Амброс. Чтобы выяснить, какую роль играет этот предполагаемый белок, Амброс и его коллеги клонировали ген C. elegans и изучили его продукт - и обнаружили, что действие гена может быть опосредовано не каким-либо белком, а только продуктом РНК гена. Эта молекула выглядела до смешного короткой: всего 22 нуклеотида в длину - просто клочок молекулы для таких серьезных эффектов развития.
Это была первая известная микроРНК (миРНК). Сначала «мы подумали, что это может быть особенностью C. elegans», - говорит Амброс. Но в 2000 году Гэри Рувкун и его коллеги обнаружили, что другой из этих генов миРНК у C. elegans, называемый let-7, появляется в практически идентичной форме у многих других организмов, включая позвоночных, моллюсков и насекомых. По словам Амброса, это означает, что данный ген является очень древним и «должен был существовать в течение 600-700 миллионов лет», прежде чем эти разнообразные виды разошлись по разным дорогам. Если миРНК настолько древние, «значит, должны были существовать и другие».
И действительно, они есть. Сегодня в геноме человека идентифицировано более 2 000 миРНК, как правило, выполняющих регуляторные функции. Один из основных способов работы миРНК - вмешательство в трансляцию транскрипта мРНК гена в соответствующий белок. Как правило, миРНК образуется из более длинной молекулы, длиной около 70 нуклеотидов, известной как пре-миРНК. Эта молекула захватывается ферментом Dicer, который измельчает ее на более мелкие фрагменты. Эти фрагменты, теперь уже миРНК, перемещаются к классу белков, называемых аргонавтами, которые являются компонентами белкового ансамбля, называемого комплексом РНК-индуцированного сайленсинга (RISC). МиРНК направляют RISC к мРНК, и это либо останавливает перевод мРНК в белок, либо приводит к ее деградации, что имеет тот же эффект. Это регуляторное действие миРНК направляет процессы, начиная от определения «судьбы» клеток (специализированных типов клеток, в которые они превращаются) до их гибели и управления клеточным циклом.
Ключевое понимание того, как такие малые РНК могут регулировать другие РНК, появилось благодаря исследованиям молекулярных биологов Эндрю Файра, Крейга Мелло и их коллег на модели C. elegans в 1998 году, за которые Файр и Мелло были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2006 году. Они выяснили, что RISC направляется немного другими нитями РНК, названными малыми интерферирующими (si) РНК. Процесс заканчивается тем, что мРНК разрезается пополам, что называется РНК-интерференцией.
Однако миРНК представляют собой загадку. Последовательность каждой миРНК обычно совпадает со многими мРНК. Как же тогда можно избирательно выбирать гены, которые они заглушают? Одна из возможностей заключается в том, что миРНК работают в группах, где несколько миРНК объединяют свои усилия для регуляции определенного гена. Именно различные комбинации, а не отдельные фрагменты, соответствуют конкретным генам и их миРНК.
Почему регуляция генов миРНК работает таким сложным образом? Амброс предполагает, что это может способствовать «эволюционной текучести»: множество способов, которыми различные миРНК могут работать вместе, и количество возможных целей, которые может иметь каждая из них, обеспечивают большую гибкость в том, как регулируются гены и, следовательно, какие характеристики могут быть получены в результате. Это дает организму множество эволюционных возможностей, что позволяет ему лучше приспосабливаться к меняющимся обстоятельствам.
Один класс малых РНК регулирует экспрессию генов путем прямого вмешательства в транскрипцию в клеточном ядре, вызывая деградацию мРНК. Эти PIWI-взаимодействующие (pi) РНК работают в паре с классом белков, называемых PIWI-аргонавтами. ПиРНК действуют в зародышевых клетках (гаметах), где они борются с «эгоистичными» последовательностями ДНК, называемыми транспозонами или «прыгающими генами»: последовательностями, которые могут вставлять свои копии по всему геному в разрушительном порядке. Таким образом, пиРНК являются «частью иммунной системы генома», - объясняет Юлиус Бреннеке из Института молекулярной биотехнологии Австрийской академии наук. Если система пиРНК искусственно отключается, «геномы гамет полностью измельчаются, и организм становится полностью стерильным», - говорит он.
Другие типы нкРНК, называемые малыми нуклеолярными РНК, работают внутри клеточных сегментов, называемых нуклеолами, и помогают изменять РНК в рибосомах - фабриках по производству белков в клетке, а также трансфер РНК и мРНК. Все эти способы регулируют экспрессию генов. Существуют и кольцевые РНК: молекулы мРНК (особенно в нейронах), которые сшиваются в кольцевую форму, прежде чем попасть за пределы ядра в цитоплазму. Неясно, насколько важны циркулярные РНК - некоторые из них могут быть просто транскрипционным «шумом», - но есть некоторые свидетельства того, что по крайней мере некоторые из них выполняют регуляторные функции. Кроме того, существуют сводные РНК, которые помогают транспортировать другие молекулы внутри клеток и между ними, малые РНК, которые модифицируют другие нкРНК, участвующие в процессинге РНК, и многое другое. Распространение разновидностей нкРНК подкрепляет утверждение Маттика о том, что РНК, а не ДНК, является «вычислительным двигателем клетки».
Если нкРНК действительно влияют на обработку клеткой генетической информации, возможно, их можно будет использовать в медицине. Заболевания часто являются результатом того, что клетка делает что-то не то, потому что получает неправильные регуляторные инструкции: например, клетки, которые теряют надлежащий контроль над циклом роста и деления, могут стать причиной опухолей. В настоящее время в медицине для воздействия на нкРНК и изменения их регуляторных эффектов часто используют нити РНК, называемые антисмысловыми олигонуклеотидами (ASO). Эти нити нуклеиновой кислоты имеют последовательности, комплементарные целевой РНК, поэтому они соединяются с ней и выводят ее из строя. ASO существуют с конца 1970-х годов. Однако их трудно было использовать в клинических условиях, поскольку они быстро разрушаются в клетках и имеют тенденцию связываться с неправильными мишенями, что может привести к серьезным последствиям.
Однако некоторые ASO разрабатываются для отключения лнкРНК, которые ассоциируются с такими видами рака, как рак легких и острый миелоидный лейкоз. Другие лнкРНК могут сами выступать в качестве медикаментов. Одна из них, известная как MEG3, по предварительным данным, действует как супрессор опухолей. Малые синтетические молекулы, которые легче, чем ASO, настраивать и доставлять в организм в качестве препаратов, также изучаются на предмет связывания с лнкРНК или иного ингибирования их взаимодействия с белками. Однако заставить эти методики работать оказалось не так-то просто. «Насколько мне известно, ни одна мишень на основе лнкРНК или терапевтическое средство не были запущены в клиническую разработку, - говорит Джинджерас.
Нацеливание на более мелкие регуляторные РНК, такие как миРНК, может оказаться более приемлемым с клинической точки зрения. Поскольку миРНК обычно поражают множество мишеней, они могут делать много вещей одновременно. Например, миРНК из семейств, обозначаемых miR-15a и miR-16-1, действуют как супрессоры опухолей, воздействуя на несколько генов, которые сами подавляют гибель клеток (апоптоз, защита от рака), и в настоящее время изучаются для лечения рака.
Однако проблема использования малых РНК в качестве лекарств заключается в том, что они вызывают иммунный ответ. Именно потому, что иммунная система нацелена на защиту от вирусных РНК, она обычно распознает и атакует любую «несамостоятельную» РНК. Одна из стратегий защиты терапевтической РНК от иммунной атаки и деградации заключается в химической модификации ее основы таким образом, чтобы она образовывала неестественную «замковую» кольцевую структуру, которую деградирующие ферменты не могут легко распознать.
Некоторые короткие ASO, нацеленные на РНК, уже одобрены для клинического применения, например, препараты инотерсен для лечения амилоидоза и голодирсен для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Исследователи также изучают антисмысловые РНК длиной менее 21 нуклеотида, нацеленные на природные регуляторные миРНК, поскольку только при превышении этой длины РНК может вызвать иммунную реакцию.
Медицина на основе РНК находится на начальном этапе своего развития именно потому, что значение самих нкРНК в биологии человека еще относительно ново и не до конца изучено. Чем больше мы будем понимать ее повсеместную природу, тем больше мы будем ожидать использования РНК для контроля и улучшения нашего здоровья. Нильс Вальтер из Центра РНК-биомедицины при Мичиганском университете в статье, опубликованной в начале 2024 года, пишет, что растущие перспективы РНК-терапии «лишь делают необходимость расшифровки функций нкРНК еще более насущной». Успех в достижении этой цели, добавляет он, «наконец-то выполнит все обещания проекта „Геном человека“».
Несмотря на такой потенциал некодирующих РНК в медицине, продолжаются споры о том, насколько они действительно важны для наших клеток. Генетики Крис Понтинг из Эдинбургского университета и Уилфрид Хаерти из Института Эрлхэма в Норвиче (Англия) относятся к числу скептиков. В статье, опубликованной в 2022 году, они утверждают, что большинство лнкРНК - это просто «транскрипционный мусор», случайно транскрибируемый из случайных участков ДНК. «Относительно немногие человеческие лнкРНК... вносят существенный вклад в развитие, физиологию или поведение человека», - пишут они.
Бреннеке советует с осторожностью относиться к нынешним высоким оценкам количества некодирующих генов. Хотя он согласен с тем, что такие гены «долгое время были недооценены», он говорит, что не стоит сразу предполагать, что все лнкРНК имеют свои функции. Многие из них транскрибируются только на низком уровне, чего и следовало ожидать, если бы они действительно были просто беспорядочным «шумом». Генетик Адриан Берд из Эдинбургского университета отмечает, что количество подавляющего большинства нкРНК, по-видимому, не превышает одной молекулы на клетку. «Трудно представить, как нкРНК могут выполнять важные функции, если они отсутствуют в большинстве клеток», - считает он.
Однако Джинджерас возражает, что такой низкий уровень экспрессии может отражать специфическую для каждой ткани роль нкРНК. Некоторые из них, по его словам, экспрессируются в одной части ткани больше, чем в другой, что говорит о том, что уровень экспрессии в каждой клетке чувствителен к сигналам, поступающим из окружающих тканей. Лоуренс отмечает, что, несмотря на низкий уровень экспрессии, в клетках определенного типа часто наблюдаются общие паттерны экспрессии, что затрудняет утверждение о том, что транскрипция носит просто случайный характер. А Холл сомневается, что клетки действительно настолько склонны к «плохому ведению домашнего хозяйства», что постоянно производят много бесполезной РНК. Предположение Лоуренса и Холла о том, что некоторые лнкРНК оказывают коллективное влияние на структуру хроматина, означает, что ни одна из них не нужна при высоком уровне экспрессии и что их точная последовательность не имеет большого значения.
Отсутствие специфичности последовательностей и целей связывания, говорит Дингер, означает, что мутация нуклеотида в нкРНК обычно не оказывает такого негативного влияния на ее функцию, как это происходит в белок-кодирующей последовательности ДНК. Поэтому неудивительно, что вариации последовательностей довольно велики. Дингер утверждает, что логичнее считать, что «генетически закодированные молекулы потенциально функциональны, пока не доказано обратное, а не являются мусором, если не доказана их функциональность». Некоторые члены коллектива ENCODE теперь согласны с тем, что не все из 75% или около того транскрипций человеческого генома могут быть функционально значимыми. Но многие исследователи утверждают, что, несомненно, гораздо больше некодирующих молекул выполняют значимые действия, чем предполагалось ранее.
Доказательство функциональной роли лнкРНК часто оказывается непростой задачей. Отчасти, по мнению Джинджераса, это может быть связано с тем, что лнкРНК может не быть биохимически активной молекулой в данном процессе: она может быть расщеплена на короткие РНК, которые, собственно, и выполняют работу. Но поскольку длинные и короткие РНК обычно характеризуются с помощью разных методов, исследователи могут в итоге искать не то, что нужно. Более того, длинные РНК часто разрезаются на фрагменты, а затем снова сращиваются в различных комбинациях, причем точный порядок часто зависит от состояния клетки-хозяина.
В основе споров о некодирующих РНК лежит вопрос о том, какую молекулу считать «функциональной». Должен ли критерий основываться на том, сохраняется ли последовательность между различными видами? Или удаление молекулы из репертуара организма приводит к какому-то наблюдаемому изменению признака? Или просто можно ли доказать, что она участвует в каком-то биохимическом процессе в клетке? Если повторяющиеся РНК действуют коллективно как «строительные леса» для хромосом или если миРНК действуют как своего рода регуляторный ансамбль, можно ли считать, что любая отдельная из них действительно имеет «функцию»?
По признанию Джинджераса, его озадачивают постоянные заявления о том, что нкРНК - это просто шум или хлам, поскольку появляется все больше доказательств того, что они выполняют множество функций. «Непонятно, почему предпринимаются такие усилия, чтобы убедить коллег перейти от чувства интереса и любопытства к области нкРНК к более сомнительному и критическому», - говорит он. Возможно, споры так ожесточены, потому что они подрывают наши представления о том, как устроена биология. С тех пор как было сделано эпохальное открытие о двойной спирали ДНК и о том, как она кодирует информацию, основой молекулярной биологии является идея о том, что существуют точно закодированные инструкции, которые программируют определенные молекулы на выполнение конкретных задач. Но нкРНК, похоже, указывают на более размытую, более коллективную логику жизни.
Эту логику сложнее разглядеть и труднее понять. Но если ученые научатся жить с этой неопределенностью, такой взгляд на жизнь может оказаться более полным.
