В перечень основных грамположительных патогенов входят метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA) и ванкомицин-резистентный S. aureus (VRSA), поскольку они играют ведущую роль в этиологии широкого спектра вне- и внутрибольничных инфекций человека.
Большинство новых антибиотиков, открытых за последние 30 лет, проявили активность в основном против грамположительных бактерий, в связи с чем резистентность к антибиотикам среди грамположительных бактерий является тревожным явлением.
Антимикробные пептиды (AMPs) различного происхождения считаются мощным оружием против резистентной формы патогенов. Нерибосомальные пептидные антибиотики (NRPs) вызывают значительный интерес с точки зрения их терапевтического потенциала. Гликопептид ванкомицин является традиционным антибиотиком с долгой клинической историей, берущей начало в 1950-х годах, а распространение ванкомицин-резистентных штаммов бактерий произошло в 1980-х годах. Липопептид даптомицин был открыт в 1985 году и одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в 2003 году. Хотя даптомицин стал доступен в медицинской практике относительно недавно, уже широко появились изоляты, резистентные к даптомицину. Рамопланин представляет собой гликолиподепсипептид, который содержит углеводную молекулу и жирную кислоту, присоединенные к пептидному ядру. Рамопланин был открыт в 1980-х годах, а статус последнего доступного клинического испытания - фаза III для лечения VRE. Резистентный к рамопланину штамм S. aureus был выделен in vitro в 2010 году.
Недавно среди метаболитов актиномицета Streptomyces roseoflavus INA-Ac-5812 были обнаружены новые липогликопептиды. Эти липогликопептиды были впервые описаны в 2016 году (Лапчинская и др., 2016) и впоследствии названы гаусемицинами А и В (Тюрин и др., 2021). Гаусемицин А - макроциклический пептид, содержащий 14 аминокислот, где тирозин гликозилирован арабинозой, что делает гаусемицин А уникальным среди природных пептидных антибиотиков (Тюрин и др., 2021). Ближайшими структурно родственными соединениями являются депсипептиды (даптомицин, таромицины и кадазиды) и циклопептиды (амфомицин, румицины и малацидины) (Тюрин и др., 2021). Гаусемицин А демонстрирует быструю мембраноразрушающую активность против планктонных S. aureus. Гаусемицин А способен ингибировать встроенные в биопленку стафилококковые клетки, в то время как даптомицин был неактивен (Васильченко и др., 2020).
Таким образом, вышеупомянутые свойства гаусемицина А делают его альтернативой существующим антибиотикам для лечения инфекционных заболеваний, вызванных S. aureus. Однако прежде чем новое вещество перейдет к доклиническим исследованиям, необходимо оценить его способность генерировать резистентные к антибиотикам варианты бактерий. В связи с этим целью данной работы является оценка способности модельного штамма S. aureus FDA209P развивать резистентность к новому липогликопептиду гаусемицину А, а также выявление геномных и фенотипических изменений, происходящих в популяции S. aureus под воздействием терапии.
Настоящая работа является вторым доказательством резистентности бактерий к липогликопептидам после исследования Шмидтом резистентного к рамопланину S. aureus (Schmidt et al., 2010). Рамопланин и даптомицин являются пептидными антибиотиками, сходными по структуре и/или механизму действия, и также доступны в качестве коммерческих препаратов. Полученные результаты показывают, что развитие резистентности к гаусемицину А происходило гораздо быстрее, чем к даптомицину, но гораздо медленнее, чем к рамопланину.
Поскольку структура молекулы гаусемицина А уникальна, было бы интересно определить, будет ли штамм S. aureus 5812R перекрестно резистентным к ближайшим аналогам и другим антибиотикам. Было установлено, что резистентность к гаусемицину А не обеспечивает резистентности к низину, ванкомицину и рамопланину. Эти пептидные антибиотики объединены одной мишенью внутри бактериальных клеток. Например, низин оказывает мембраноразрушающее действие при связывании с рецептором, которым является липид II. Ванкомицин - катионный гликопептид, который убивает бактерии, связываясь с С-концевыми D-Ala-D-Ala остатками предшественника пептидогликана липида II, и предотвращает использование этого предшественника для синтеза клеточной стенки. Пирофосфатный карман липида II также является мишенью для рамопланина.
Нашей основной задачей было выяснить, какие изменения могут быть ответственны за резистентность стафилококков к гаусемицину А. Прежде всего, необходимо было оценить изменения на уровне генома. Сравнение геномов S. aureus FDA209P и S. aureus 5812R выявило делеции. Среди мутаций, hepT и kdpE - гены, которые могут иметь наибольший вклад в формирование резистентности к гаусемицину А.
Нашей вторичной целью было найти фенотипические изменения, которые связаны с резистентностью стафилококков к гаусемицину А. Мы оценили структурные изменения, произошедшие с цитоплазматической мембраной, поскольку она является основной мишенью для гаусемицина А (Васильченко и др., 2020). Равновесие бактериальной мембраны между жесткостью и текучестью определяется множеством факторов, влияющих на порядок мембраны (вода, ионы металлов, белки, каротиноиды, стафилоксантин и т.д.), среди этих факторов главным является состав жирных кислот фосфолипидов.
Основные липиды мембраны S. aureus состоят из отрицательно заряженных фосфолипидов: фосфатидилглицерина (ФГ) и кардиолипина (КЛ). Синтазы кардиолипина являются критическими ферментами для синтеза КЛ в бактериях. Известно, что мутация в гене csl2 повышает восприимчивость к даптомицину у S. aureus, а повышенный уровень кардиолипина связан с резистентностью к даптомицину у энтерококков. Мы обнаружили, что штамм S. aureus 5812R показал повышенную относительную экспрессию гена cls2. Похоже, что кардиолипин играет более важную роль в устойчивости стафилококков к гаусемицину А, чем к даптомицину, что можно объяснить различиями в их физико-химических свойствах. Молекула гаусемицина А имеет более отрицательный чистый заряд по сравнению с даптомицином. Измерение дзета-потенциала показало, что популяция S. aureus FDA209P состоит из клеток, которые немного более положительно заряжены по сравнению с популяцией S. aureus 5812R. Хотя разница невелика, она может способствовать резистентности к гаусемицину А.
Противомикробные пептиды все больше признаются в качестве перспективного класса соединений, которые используются в сочетании с обычными антибиотиками. В связи с этим мы попытались преодолеть резистентность к гаусемицину А, выбрав ту комбинацию, в которой пара антибиотиков воздействует на другую клеточную мишень, например, на репликацию ДНК или синтез белка. Кроме того, мы протестировали комбинацию гаусемицина А и даптомицина и, к удивлению, выявили антагонизм между ними по неизвестной причине. Аналогичная работа показала, что комбинации даптомицина с другими пептидными антибиотиками приводили к индифферентному взаимодействию, в то время как комбинация даптомицин + ципрофлоксацин оказывала синергетический эффект против S. aureus (Mataraci and Dosler, 2012). Многочисленные исследования продемонстрировали эффективность комбинации даптомицина с антибиотиками, направленными на репликацию нуклеиновых кислот. В нашем исследовании было установлено, что комбинация ципрофлоксацина и гаусемицина А обладает синергической активностью против резистентного к гаусемицину А S. aureus. Таким образом, было выявлено, что такая комбинация может быть успешной для подавления резистентных к гаусемицину А S. aureus.
В данном исследовании мы показали способность S. aureus FDA209P формировать фенотип резистентности к гаусемицину А. Однако выявленное явление не означает, что этот пептидный антибиотик не имеет перспектив в качестве терапевтического агента. Рамопланин показал еще более выраженную способность формировать резистентный фенотип S. aureus в этом сравнительном эксперименте. Кроме того, S. aureus 5812R не формировал значительной перекрестной резистентности к антибиотикам, которой обладают другие клеточные мишени, что позволяет рассматривать гаусемицин А в комбинированной терапии с традиционными антибиотиками, такими как ципрофлоксацин.
