Быстрое и точное обнаружение ДНК патогенов, вызывающих заболевания, необходимо для контроля распространения инфекций и своевременного лечения.
Хотя традиционные методы молекулярной диагностики, такие как ПЦР, обладают высокой чувствительностью, они включают амплификацию нуклеиновых кислот, и многие из них должны проводиться в централизованных лабораториях, что ограничивает их применение в пунктах оказания медицинской помощи. Последние достижения в области диагностики на основе CRISPR (CRISPR-Dx) продемонстрировали потенциал для высокоспецифичной молекулярной детекции, но чувствительность часто ограничивается медленной расщепляющей активностью ферментов Cas, что требует предварительной амплификации целевых нуклеиновых кислот.
Инфекции кровотока требуют быстрого выявления для предотвращения осложнений, однако стандартные методы диагностики основаны на ПЦР и изотермических методах амплификации, которые имеют длительное время обработки. Средства обнаружения на основе CRISPR, такие как SHERLOCK и DETECTR, улучшили специфичность, но по-прежнему зависят от амплификации, что ограничивает время их работы и практичность в клинических условиях.
Исследователи Иллинойского университета разработали диагностический тест на основе CRISPR, способный выявлять инфекции кровотока за считанные минуты без необходимости амплификации нуклеиновых кислот. CRISPR-каскадный анализ достигает аттомолярной чувствительности и включает логическую функцию OR-gated для одновременной идентификации нескольких патогенов, связанных с инфекциями кровотока, по их ДНК. В статье, опубликованной в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences, ученые провели лабораторное исследование, чтобы определить, может ли управляемая CRISPR петля обратной связи обнаруживать патогенную ДНК в сверхнизких концентрациях без амплификации.
Их реакция CRISPR-Cascade использует два рибонуклеопротеиновых комплекса, T1 и T2. При распознавании цели Cas12a в комплексе T1 расщепляет заблокированные нуклеиновые кислоты, что приводит к высвобождению переключаемой клеточной РНК, которая активирует большее количество ферментов Cas12a в комплексе T2. Эта самоподдерживающаяся петля обратной связи обеспечивает быстрое флуоресцентное обнаружение при аттомолярной чувствительности в течение 10 минут. Оптимизация температуры реакции (33°C) и кинетики фермента повысила специфичность и снизила неспецифические помехи.
В ходе испытаний тест успешно идентифицировал метициллин-чувствительный Staphylococcus aureus (MSSA), метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA), кишечную палочку (E. coli) и вирус гепатита B в образцах цельной крови. Сравнение с существующими методами показало значительное ускорение сроков получения результатов. CRISPR-Cascade, включая подготовку образцов, занимает около получаса, что делает его самым быстрым из доступных методов диагностики инфекций кровотока. Существует также потенциал для дальнейшего улучшения подготовки образцов и приближения к отметке менее 15 минут. Полученные результаты свидетельствуют о способности CRISPR-каскадного анализа обеспечивать высокочувствительное и специфическое молекулярное обнаружение, что открывает путь для перспективных применений в клинической диагностике.
