Традиционное секвенирование часто сравнивают с приготовлением коктейля: исследователи смешивают кучу клеток, получают усредненную последовательность и делают выводы об ингредиентах, из которых состоит эта смесь.
Совсем недавно ученые получили возможность проводить секвенирование отдельных клеток, что позволяет выявить редкие различия между клетками и эволюцию клеточных линий. Однако существующие методы требуют чтения генома короткими участками и поэтому часто не могут охватить сложные повторяющиеся области, которые ученые все чаще связывают со здоровьем и заболеваниями. Технологии длинного прочтения могут преодолеть этот недостаток, однако их методы требуют гораздо больше ДНК, чем можно извлечь из одной клетки. Секвенирование с длинным прочтением для одной клетки оставалось труднодоступным.
Так было до сих пор. Объединив "два инновационных подхода" - передовую технику амплификации ДНК и последние достижения в секвенировании ДНК - группа ученых применила технологию длинного прочтения к одиночным клеткам, рассказывает Александр Хойшен, исследователь геномных технологий в Медицинском центре Университета Радбоуда в Нидерландах, который не принимал участия в исследовании. "Это было немыслимо всего два-три года назад", - говорит он. Это достижение может позволить более детально изучить мутации, лежащие в основе всевозможных заболеваний.
В последнее десятилетие длина считывания - результат секвенирования ДНК - становится все более значительной. Секвенирование с длинными считываниями позволило ученым определять последовательность проблемных "темных областей" генома, недоступных для технологий с короткими считываниями, либо из-за обилия гуанинов и цитозинов, либо из-за дублированных областей, которые трудно картировать на хромосоме.
Однако для секвенирования с длинным прочтением требуется огромное количество ДНК. Необходимо несколько микрограммов генетического материала, но "одна клетка содержит всего шесть пикограмм", - поясняет Джоанна Хорд, специалист по вычислительной биологии. По ее словам, "прежде чем вы сможете составить последовательность, требуется значительная амплификация".
И именно здесь возникают сложности, говорит Хорд, поскольку основные методы, используемые для амплификации ДНК, подвержены "смещению амплификации": тенденции к увеличению числа определенных последовательностей за счет других. И вот недавно, Хорд и коллеги получили длинные прочтения из отдельных клеток с помощью усовершенствованного метода амплификации ДНК. Хотя эти результаты еще не прошли рецензирование, они были опубликованы в препринте, загруженном на bioRxiv 23 января.
Чтобы минимизировать смещение амплификации, команда использовала метод, называемый капельной амплификацией с множественным смещением (droplet-based multiple displacement amplification). Он работает путем захвата фрагментов ДНК в капли, содержащие ограниченный запас реагентов, что предотвращает чрезмерную амплификацию определенных регионов. "Происходит более равномерная амплификация, что позволяет лучше представить геном", - пояснил Адам Амер, биоинформатик из Уппсальского университета в Швеции.
Исследователи проводили амплификацию на основе капель в отдельных человеческих Т-лимфоцитах, а затем генерировали длинные чтения с помощью технологии PacBio HiFi. По сравнению с секвенированием с короткими чтениями, новый метод позволил выявить в четыре раза больше структурных вариантов - крупных перестроек ДНК, включая те, которые расположены в недоступных "темных областях" генома.
Исследователи использовали новый подход для секвенирования ДНК двух разных Т-клеток, полученных от одного и того же человека. Данные секвенирования выявили 28 соматических мутаций, отличающих эти две клетки, включая изменения в митохондриальной ДНК. Новый метод может позволить ученым изучить влияние соматических мутаций на огромное количество заболеваний.
Например, опухоли часто представляют собой мозаику генетических вариаций, поскольку различные клетки независимо друг от друга приобретают мутации, известные как субклональные мутации, которые делают опухоль более агрессивной. Улучшенное секвенирование ДНК отдельных клеток может помочь "выявить субклональные мутации, которые часто прячутся в раковых опухолях", - считает Кристофер Мейсон, биофизик из Weill Cornell Medicine в Нью-Йорке, который не принимал участия в исследовании.
Здоровые клетки также накапливают мутации на протяжении всей своей жизни, хотя это менее опасно для клеток кожи и кишечника, которые регулярно обновляются, чем для долгоживущих клеток нашего мозга. Но соматические мутации в нейронах и других клетках мозга могут влиять на работу мозга и способствовать развитию неврологических заболеваний, включая шизофрению, синдром Туретта и аутизм.
Константина Теофанопулу, научный сотрудник Хантер-колледжа, не принимавшая участия в исследовании, говорит, что ее исследования уже выиграли от достижений в области секвенирования ДНК. Длинные прочтения геномов позвоночных помогли ей раскрыть эволюционную историю рецепторов и лигандов, обеспечивающих социальную коммуникацию. Но, по ее словам, длинные прочтения, полученные из отдельных клеток, могут стать важнейшим инструментом для выявления генетических вариантов при речевых расстройствах, которые она изучает.
Однако техника не совершенна, признают исследователи. Несмотря на то, что амплификация на основе капель лучше, чем существующие методы масштабирования ДНК, она может приводить к ошибкам и образованию "химерных" образований, когда соседние части генома сцепляются друг с другом. Хотя в текущей работе им удалось выявить и удалить химеры, их строгий метод фильтрации также отбрасывает правильные прочтения. Исследователи работают над оптимизацией условий, чтобы уменьшить количество ошибок во время амплификации.
"Я рассматриваю это как доказательство принципа, где мы показываем, что все, что было сделано с длинными прочтениями в больших образцах, может быть сделано и на уровне одной клетки", - говорит Амер. "Теперь мы действительно можем изучать отдельные клетки более детально", - добавляет он.
