Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН усовершенствовали конструкцию генетического вектора, с помощью которого в клетках млекопитающих можно синтезировать белки, используемые для лечения различных заболеваний, например гемофилии и бесплодия.
Авторы уменьшили размер генетической конструкции на одну треть таким образом, что уровень биосинтеза модельного белка увеличился на 20%, сохранив а способность векторной плазмиды поддерживать постоянный уровень биосинтеза белков в течение 60 дней практически не изменилась. Результаты исследования опубликованы в журнале PeerJ.
Биотехнологи всего мира используют клетки яичника китайского хомячка CHO, чтобы производить самые разные терапевтически важные белки, например антитела, гормоны, факторы свертывания крови. Для того, чтобы клетки нарабатывали нужное вещество, в них искусственно вводят плазмиду, то есть кольцевую молекулу ДНК, содержащую ген интересующего белка. А чтобы синтез шел стабильно и в больших количествах, этот ген помещают под контроль сильного промотора — регуляторной генетической последовательности, которая обеспечивает постоянную активность гена, а значит и наработку белка.
Ранее ученые из лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН разработали вектор, позволяющий синтезировать в клетках яичника китайского хомячка факторы свертывания крови VIII и IX в необычно больших количествах, а также фолликулостимулирующий гормон человека. Эти белки применяются в медицине для лечения гемофилии и болезней женской репродуктивной системы соответственно.
Однако полученные авторами векторные плазмиды были довольно большими по размеру (около 12 тысяч пар нуклеотидов), что негативно отражалось на их способности встраиваться в геном клеток. Поэтому в новой работе исследователи попытались уменьшить векторную плазмиду, удаляя из нее участки ДНК, окружающие промотор и терминатор гена два «балластных» участка, никак не влияющих на активность гена. В результате ученые получили 6 различных плазмид размером от 13 до 8 тысяч пар нуклеотидов.
Чтобы проверить стабильность усовершенствованных плазмид, исследователи встроили в них ген зеленого флуоресцентного белка, по свечению которого можно точно отслеживать, как работает плазмида в клетке. Затем полученные конструкции ввели в клетки яичника китайского хомячка, селекцией отобрали такие клетки, в которых плазмида встроилась в геном и затем размножили копии встроенных плазмид при помощи геномной амплификации.
Наблюдения в течение 80 дней за отобранными клетками показали, что наработка встроенного в плазмиду белка сохраняется длительное время, при этом активность его синтеза несколько уменьшается для всех вариантов плазмид, но намного сильнее (в 3 раза) падает для плазмиды, в которой удалены все регуляторные участки ДНК перед самим промотором EEF1A1 Такая же низкая стабильность работы целевого гена фиксировалась для широко распространенных в биофармацевтике контрольных плазмид с вирусным промотором CMV. Среди укороченных плазмид с промотором EEF1A1 была отобрана такая, в которой целевой белок синтезировался на 20% быстрее, чем в исходной длинной плазмиде. Поэтому ее можно использовать для промышленной наработки терапевтически значимых молекул. Препарат этой векторной плазмиды был депонирован в международной коллекции Addgene и может бесплатно использоваться учеными. В России и Белоруссии препараты плазмиды для научных исследований могут быть получены у авторов статьи.
«Укороченные плазмиды перспективны в качестве векторов потому, что они так же хорошо, как и исходные длинные плазмиды сохраняются в клетках, но с них быстрее нарабатывается нужный белок. Так, наши эксперименты показали, что скорость синтеза целевого белка можно увеличить на 20%, просто удалив из плазмиды функционально незначимые последовательности. Сейчас мы уже применили новый вариант вектора для создания промышленного продуцента одного из гонадотропных гормонов и готовим материалы к публикации», — рассказывает Иван Воробьев, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН.
