Если ехать из аэропорта в Лонгйир, крупнейший город на архипелаге Шпицберген, справа на горе из песчаника можно видеть возвышающееся бетонное сооружение. Это вход в Глобальное хранилище семян на Шпицбергене, где под землей хранится более 1 миллиона образцов пшеницы, риса, кукурузы и других сельскохозяйственных культур, как неприкосновенный запас на случай глобальной катастрофы.
Хранилище расположено именно здесь, потому что даже если система охлаждения, обеспечивающая хранение семян при температуре -18°C, выйдет из строя, вечная мерзлота обеспечит сохранность семян в течение сотен лет. Здесь, примерно в 1300 километрах от Северного полюса, сама земля выполняет функцию морозильника. Именно по этой причине Себастьен Кальвиньяк-Спенсер приехал на Шпицберген в середине июля. Биолог-эволюционист из Института здравоохранения имени Гельмгольца (Германия) Кальвиньяк—Спенсер интересуется эволюцией вирусов, геномы которых состоят из РНК - более хрупкой молекулы, чем ее родственница ДНК. Хранившиеся тысячи лет последовательности древней ДНК изменили представления ученых об истории бактериальных заболеваний, таких как чума и сифилис, а также натуральной оспы, вызываемых вирусами с ДНК-геномом. Они также произвели революцию в наших представлениях о происхождении человека и его миграциях.
Древняя РНК может хранить свои собственные секреты, в том числе о том, как эволюционировали вирусы, вызывающие грипп, полиомиелит и Эболу, и как изменились их взаимоотношения с животными и людьми, например, в результате промышленной революции или развития современного сельского хозяйства. Но до сих пор было секвенировано очень мало древних РНК. Немногим опубликованным образцам более 100 лет, и ученые уверены, что некоторые из них являются лабораторной контаминацией. “Там почти ничего нет”, - считает Эдвард Холмс, эксперт по эволюции вирусов из Сиднейского университета (Австралия).
Кальвиньяк-Спенсер признает, что РНК, как правило, разрушается быстрее, чем ДНК. Но он считает, что ее хрупкость стала догмой, которая мешает исследователям даже искать ее. За последние годы он добился ряда успехов в восстановлении старых геномов вирусов кори, гриппа и других вирусов из зафиксированных в формалине образцов тканей в музеях. На Шпицбергене он надеется показать, что в холодной сухой вечной мерзлоте геномы РНК—вирусов могут сохраняться гораздо дольше - возможно, тысячи или даже сотни тысяч лет. “У них здесь есть хранилище семян, возможно, у них есть и хранилище вирусов”, - говорит он.
Хендрику Пойнару, возглавляющему Центр древней ДНК в Университете Макмастера (Канада), не терпится увидеть, к чему приведет исследование Кальвиньяка-Спенсера. Он согласен с тем, что хрупкость РНК иногда переоценивается, и предсказывает, что новые методы, некоторые из которых разрабатываются в его собственной лаборатории, могут вскоре дать сильный толчок развитию этой области. “Я думаю, что очень скоро в этой области произойдет революция”, - говорит Пойнар.
Лонгйир, самый северный город в мире, - необычное место. Летом солнце не заходит около 4 месяцев и население, составляющее около 2000 человек, удваивается из-за притока туристов и исследователей. Постоянный свет может как заряжать энергией, так и немного дезориентировать. За пределами города обязательно носить с собой винтовку из-за риска нападения белого медведя. Всю свою карьеру проработав в офисах и лабораториях, “я был сильно удивлен, оказавшись на Шпицбергене”, - рассказывает Кальвиньяк-Спенсер. Однако в остальном он оказался именно там, где хотел быть.
Ребенком, выросшим в Тулузе, Франция, Кальвиньяк-Спенсер был очарован динозаврами и мечтал стать палеонтологом. Диссертацию он защитил в лаборатории по изучению древней ДНК в Лионском университете, работая частично над вирусами бурых медведей, а частично над ретровирусами у людей и обезьян. “Это заставило меня осознать, что меня действительно интересует эволюция возбудителей инфекций”, - рассказал он. В 2010 году, после получения степени, он присоединился к Фабиану Лендертцу, ветеринару, изучающему диких животных, работавшему в то время в Институте Роберта Коха (Германия), который изучал патогенные микроорганизмы у шимпанзе в национальном парке Таи в Кот-д'Ивуаре.
Работа в Берлине не касалась палеонтологических образцов, но Кальвиньяк-Спенсер внимательно следил за исследованиями в области древней ДНК, которые в то время были на подъеме. В 2017 году, когда их группа переехала в новое здание в Берлине, Леендерц и Кальвиньяк-Спенсер решили превратить часть свободного лабораторного пространства в лабораторию палеогенетики, отчасти для того, чтобы углубить свою работу по изучению экологии заболеваний человекообразных обезьян в прошлом. Для Кальвиньяка-Спенсера это также стало возможностью взглянуть на эволюцию инфекций в более широком плане. Исследователи ДНК изучали патогены тысячелетней давности, но он увидел нишу в анализе РНК-вирусов, полученных из более поздних образцов. Во—первых, по его словам, за последние 200 лет произошли важные изменения, которые могли повлиять на эволюцию вирусов: промышленная революция, масштабные изменения в сельском хозяйстве и широкое внедрение вакцин.
Исследователи могут сделать некоторые выводы об истории вируса, сравнив современные геномы и используя скорость геномных изменений, чтобы вычислить, когда существовал их общий предок и как он мог выглядеть. Но поскольку РНК-вирусы мутируют быстро, эта стратегия не распространяется слишком далеко в прошлое. Например, последний известный общий предок респираторно-синцитиального вируса относится к 20-му веку; шесть из восьми сегментов генома гриппа относятся к 19-му веку. “Таким образом, мы быстро подходим к своего рода филогенетическому горизонту и не видим дальше него”, - объясняет Кальвиньяк-Спенсер.
Древняя РНК может обойти это ограничение, но найти ее сложно. Бактерии, вызывающие сифилис и проказу, оставляют следы на человеческих скелетах, которые могут помочь исследователям найти их. РНК-вирусы редко оставляют какие-либо следы, “поэтому приходится обрабатывать большое количество материала в надежде, что вам повезет”, - говорит Люси ван Дорп, микробиолог-генетик из Университетского колледжа Лондона. Кальвиньяк-Спенсер решил попробовать собрать коллекцию патогенных вирусов и начал с Берлинского музея истории медицины Шарите и для начала он выбрал 12 образцов, зафиксированных в формалине в начале 20-го века.
Одним из них было легкое 2-летнего ребенка, умершего от кори в 1912 году. Кальвиньяку-Спенсеру удалось собрать из него весь вирусный геном, который по-прежнему является старейшим человеческим РНК-вирусом, сохранившим свою генетическую схему. В статье, опубликованной в журнале Science в 2020 году, он использовал этот геном и более современные данные, чтобы точно определить, когда корь могла передаться от крупного рогатого скота к людям: не в средние века, как предполагали более ранние исследования, а уже в 500 году до н.э., когда города становились достаточно большими, чтобы поддерживать непрерывную циркуляцию.
В других образцах, взятых в ходе этого первого поиска, были обнаружены одна полная и две частичные последовательности вируса, вызвавшего пандемию гриппа 1918 года, известного как "испанка". Группа, возглавляемая вирусологом Джеффри Таубенбергером, ныне исполняющим обязанности директора Национального института аллергии и инфекционных заболеваний США, впервые расшифровала этот вирус в 2005 году, в основном на основе образцов, взятых у пациента, похороненного в вечной мерзлоте на Аляске. (Этот геном помог объяснить, почему вирус был таким смертоносным, особенно для молодых людей, в отличие от других штаммов гриппа.)
После четырех удачных проб из 12 “я подумал, что совсем неплохо получить 30% успеха в первой партии”, - рассказывает Кальвиньяк-Спенсер. “Тогда мы пошли ва-банк”. Его команда взяла образцы людей и животных из коллекций Вены, Рима, Болоньи, Италия, Парижа, Мадрида, Мюнхена и многих других городов, которые сейчас анализирует. "Его успех вдохновил других ученых", - говорит Ван Дорп. “Всякий раз, когда я с ним разговариваю, он всегда очень уверен в себе”, - говорит она. “Он говорит: ”я должен попробовать", и у него довольно высокие показатели успеха в этом".
Тем не менее, немногие патологические образцы датируются 19 веком. Старейший на сегодняшний день образец Кальвиньяка-Спенсера, взятый у больного бешенством в 1836 году, хранится в коллекции в Болонье и его еще предстоит проанализировать. “Тогда возник вопрос: о каких еще архивах мы могли бы подумать?” - рассказывает он. Одним из вариантов ответа был Шпицберген. Бесчисленные поколения гнездящихся морских птиц и других представителей дикой природы, вероятно, распространяли вирусы, которые могли сохраняться в вечной мерзлоте. Но это звучало проще, чем оказалось на самом деле.
Во второй половине первого дня экспедиции Кальвиньяк-Спенсер стоял на травянистом склоне в нескольких минутах езды от Лонгйира, осматривая квадратную яму, которую он и его коллеги только что выкопали. Исследователи наткнулись на камни и гравий примерно на глубине полуметра и тонкий слой почвы над ними не выглядел многообещающим. “Он полностью оттаял”, - сказал член экспедиции Тим Урич, почвенный микробиолог из Университета Грайфсвальда (Германия). “Наша задача будет заключаться в том, чтобы найти места, где почва залегает глубже”. Пока вдалеке лаяли хаски, исследователи начали искать следующее место для раскопок. Обнаружение грунта Шпицбергена, который оставался замороженным в течение сотен или тысяч лет, было лишь одной из многих проблем, но она имела решающее значение. Только там у древней РНК был шанс выжить.
Существует несколько причин хрупкости РНК. Сахара, входящие в ее состав, содержат больше кислорода, что повышает вероятность расщепления. РНК обычно одноцепочечная, в то время как ДНК состоит из двух нитей, сплетенных в двойную спираль, что придает ей дополнительную стабильность. Но самой большой проблемой являются рибонуклеазы, небольшие ферменты, разрушающие РНК. Организмы используют их для метаболизма избыточных клеточных РНК и в качестве защиты от патогенов, включая РНК-вирусы. Как поясняет Пойнар, рибонуклеазы, также известные как РНКазы, встречаются повсеместно и известны своей стабильностью. “Это самая большая проблема, с которой вы сталкиваетесь”.
Когда-то исследователи думали, что РНК, которой в клетках гораздо больше, чем ДНК, может сохраняться только, если ее большое количество. В 1985 году, когда Сванте Паабо, в то время аспирант Университета Уппсалы, опубликовал основополагающую статью о ДНК, извлеченной из мумий, Франко Ролло из Университета Камерино описал фрагменты РНК, обнаруженные в семенах кресс-салата, возраст которого составлял 1600 лет. Несколько лет спустя в статье в журнале Nature, озаглавленной “РНК мумий сохраняется дольше”, Ролло утверждал, что РНК, вероятно, составляла большинство всех нуклеиновых кислот в древних образцах.
Но древняя ДНК быстро завоевала популярность в качестве темы для исследований и ученые использовали ее для изучения жизни, погружаясь все дальше и дальше в прошлое. В 2013 году они опубликовали геном лошади, жившей более полумиллиона лет назад. В 2022 году они секвенировали ДНК многочисленных растений и животных, замороженных в гренландских льдах более чем на 2 миллиона лет, что позволило получить представление об экосистеме того времени. РНК оказалась на обочине, поскольку древняя ДНК привлекла большую часть средств на палеогеномику. К настоящему времени, по словам Пойнара, методы извлечения и очистки древних нуклеиновых последовательностей “ориентированы на ДНК, а не на РНК”.
И все же Ролло, возможно, был прав, говорит Том Гилберт, биолог-эволюционист из Копенгагенского университета. В начале 2000-х годов он и Майк Уороби из Аризонского университета изучали выдержанные в формалине образцы, хранящиеся в Демократической Республике Конго несколько десятилетий, в поисках ВИЧ. “Что меня поразило, так это то, что мы часто обнаруживали лучшую сохранность РНК, чем ДНК”, - говорит Гилберт. “И я подумал, что в это странно, так как РНК действительно хрупкая”. Но, отмечает он, если отключить рибонуклеазы, что могут сделать как формалин, так и холод, то как только они исчезнут, исследователи с такой же вероятностью найдут РНК 2-х-миллионной давности, как и ДНК, говорит Гилберт: “Я действительно не думаю, что этому есть предел”. Но Холмса это не убедило. “Я просто не могу представить, что [РНК] даст такой же взгляд на прошлое, как и древняя ДНК.” - говорит он. “Но это не значит, что мы не можем получить некоторые древние РНК-вирусы из некоторых действительно хорошо сохранившихся образцов”.
Пандемия COVID-19 подогрела интерес к древней РНК, поскольку в ней могут содержаться ключи к эволюции коронавирусов, говорит Ван Дорп. “РНК-вирусы - актуальная тема. Они очень интересны”. Один из самых известных в мире коронавирологов Кристиан Дростен недавно опубликовал препринт с последовательностью РНК-вируса, выделенного из летучей мыши, пойманной в северной Германии в 1919 году и хранящейся в этаноле в Берлинском музее естественной истории. По словам Дростена, это был бандавирус, который, как известно, не поражает людей, но аналогичные старые образцы коронавирусов могут помочь определить, где и когда OC43 и 229E, двоюродные братья SARS-CoV-2, вызывающие обычную простуду, впервые начали заражать людей. Архив природных РНК-вирусов на Шпицбергене открыл бы путь и для других исследований, например, для изучения эволюции гриппа до пандемии 1918 года. Кальвиньяк-Спенсер не был до конца уверен в том, что сможет обнаружить; в холодной почве могли скрываться десятки вирусов. На данный момент он просто хотел доказать, что это возможно.
Остаток первого дня группа тащила свое снаряжение по арктической тундре, останавливаясь то тут, то там, чтобы выкопать яму, но им не удавалось найти слой вечной мерзлоты. “Это своего рода личный практический опыт изучения климата”, - говорит Кальвиньяк-Спенсер. Действительно, на Шпицбергене повышение температуры было более резким, чем в большинстве других мест, и каждое лето ученым приходится копать глубже, чтобы добраться до вечной мерзлоты. Хранилище вирусов, если оно существует, возможно, выходит из строя — еще одна причина провести исследование сейчас, объясняет Кальвиньяк-Спенсер. “Мы хотим посмотреть, стоит ли этим заниматься, в том числе и с учетом того, что это может быстро исчезнуть”.
На второй день исследователи отправились к ряду крутых скал, где в период размножения собираются тысячи птиц, особенно гагарки. Неподалеку паслись северные олени и бродил песец. “Идея состоит в том, чтобы взять образцы в этих местах, где огромное количество животных обитало веками и тысячелетиями”, - сказал Кальвиньяк-Спенсер. Исследователи снова начали копать и то тут, то там натыкались на то, что казалось мерзлой почвой. Один из членов команды вбивал молотком в землю длинный полый металлический цилиндр, извлекая цилиндрическую сердцевину из земли. Надев маски, перчатки и нарукавники, чтобы предотвратить контаминацию образцов современными вирусами, ученые становились на колени на поросшую травой землю и вырезали крошечные кусочки земли из добытых проб. Используя продезинфицированный металлический пинцет, они поместили кусочки вечной мерзлоты в пробирки, нанося на них QR-ко для отслеживания того, когда и где был взят образец. Затем они помещали пробирки в термос с жидким азотом для последующей транспортировки в лабораторию в Германии.
Экспедиция на Шпицберген - не первая, кто продвигает поиск древней РНК за пределы музейных экспонатов. В 2014 году исследователи опубликовали частичный геном нового вируса, обнаруженного в замороженных экскрементах северного оленя в Канаде, датированный примерно 700-летней давностью. В том же году исследователи сообщили о полном геноме вируса, выделенного из 750-летних зерен ячменя в Египте. В 2018 году в другой статье описывался растительный вирус, выделенный из древних початков кукурузы, найденных в Аризоне.
Кальвиньяк-Спенсер также пытается работать в Антарктиде. В 2023 году он прочитал статью во французской газете о работе Стива Эмсли, орнитолога и археолога из Университета Северной Каролины, который, изучает пингвинов. С 2001 года Эмсли регулярно ездит в Антарктиду в поисках старых мест гнездования пингвинов Адели. Когда он находит их, он раскапывает лед — а значит, и прошлое — слой за слоем, находя фрагменты яичной скорлупы, перья, кости и даже целых мумифицированных птиц, которым иногда тысячи лет. Кальвиньяк-Спенсер сразу же задался вопросом, содержали ли эти мумии древние РНК-вирусы. Он связался с Эмсли, который прислал ему образцы мумий. Кальвиньяк-Спенсер говорит, что его лаборатории удалось собрать воедино геномы нескольких вирусов, включая почти полный геном ротавируса, датируемый примерно 1900-летней давностью.
Как и другие исследования древней РНК, эта работа, которая еще не опубликована, неизбежно столкнется с вопросами о лабораторной контаминации. Например, исследование 1999 года, в котором сообщалось о вирусе томатной мозаики во льду возрастом до 140 000 лет, вызвало критику. “Я не верю этой статье, потому что эти древние образцы так похожи на современные”, - говорит Холмс. Поскольку РНК-вирусы мутируют очень быстро, говорит он, “если вы видите последовательность древнего или предположительно древнего РНК-вируса, и она идентична современному вирусу, вы сразу понимаете, что что-то не так”.
Кальвиньяк-Спенсер признает, что у ротавируса пингвинов отсутствуют два типичных признака его древности. На нем не видно характерного U-образного распределения повреждений на концах фрагментов его РНК, известного как “улыбка”, хотя, по его словам, это может быть просто из-за исключительной хорошей сохранности пингвина. И когда он добавил эту последовательность к генеалогическому древу родственных вирусов, она оказалась не на короткой ветви, как ожидалось в случае вируса, который отличается от современных вирусов и ближе к вирусу-предку. Кальвиньяк-Спенсер говорит, что длинные участки РНК, возможно, сохранились благодаря исключительной сохранности пингвинов. Он также отмечает, что у ротавирусов необычный двухцепочечный РНК-геном, который может быть более долговечным. Кальвиньяк-Спенсер считает, что мумии пингвинов являются наилучшим вариантом для сохранения РНК: “Они подвергались воздействию очень холодных и очень сухих условий. Лучшего и представить нельзя”.
Он надеется найти то же самое на Шпицбергене. На третий день экспедиции Кальвиньяк-Спенсер и другие члены команды отправились на другое место, где обнаружили обнажившуюся вечную мерзлоту. На холодном ветру они копали, извлекали сердцевину и снова брали пробы - к этому времени это была уже рутинная работа. На следующий день они упаковали свои образцы и улетели обратно в Германию.
На склоне холма, возвышающегося над Лонгйиром, находится старое кладбище, всего несколько рядов белых крестов, бросающих вызов вечному ветру.
В 1998 году канадский медицинский географ Кирсти Дункан возглавила здесь экспедицию по эксгумации тел семи шахтеров, умерших от "испанки" в 1918 году. Гробы были захоронены не так глубоко, как ожидалось, возможно, из-за вечной мерзлоты, в связи с чем Шпицбергена в 1950 году запретили захоронение в гробах. Тела плохо сохранились. И в отличие от группы Таубенбергера, которая годом ранее брала образцы на Аляске, группе Дункан не удалось выделить ни одного фрагмента вируса гриппа.
Экспедиция Кальвиньяка-Спенсера, проведенная 27 лет спустя, также может оказаться безуспешной. Он оценивает вероятность обнаружения какого-либо древнего вируса в своих образцах, которые сейчас надежно хранятся в морозильной камере в Берлине, примерно в 10%. “Но на данный момент, прежде чем я скажу, что это невозможно, я просто попробую это сделать”, - говорит он, - "и попробую еще раз, если понадобится". Он уже планирует еще одну поездку на Шпицберген для поиска вирусов.
