Т-клетки CD4+ являются важной частью иммунной системы и играют ключевую роль в защите организма от патогенов.
CD4+ Т-клетки являются центральными медиаторами адаптивных и врожденных иммунных реакций и представляют собой основной резервуар для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) in vivo. Детальные исследования покоящихся CD4+ Т-клеток человека были невозможны из-за отсутствия эффективных подходов для генетических манипуляций, что ограничивает наше понимание репликации ВИЧ и сдерживает усилия по поиску методов лечения. Поскольку в состоянии покоя CD4+ Т-клетки обладают большим разнообразием защитных механизмов против ВИЧ, они образуют латентный резервуар для ВИЧ в организме, до которого в настоящее время не могут добраться противовирусные препараты.
Ученые под руководством профессора Оливера Т. Кепплера из Института Макса фон Петтенкофера разработали метод, который впервые позволяет эффективно и без особых сложностей генетически манипулировать этими специфическими иммунными клетками. Как сообщают авторы в журнале Nature Methods, это позволяет получить ранее недостижимое представление о биологии этих клеток.
Покоящиеся CD4+ Т-клетки практически не поддавались генетическим манипуляциям, поскольку имеющиеся методы обычно предполагают наличие делящихся клеток, как объясняет Кепплер. "А покоящиеся клетки не делятся по определению". В качестве первого шага в разработке нового метода ученые оптимизировали условия культивирования. В результате исследователи смогли поддерживать жизнь этих клеток в лабораторных условиях после извлечения их из крови здоровых доноров не 3-4 дня, как раньше, а до шести недель. Решающий прогресс был достигнут с помощью нуклеофекции - специального метода, позволяющего доставлять реагенты в ядро клетки.
Используя эту технику, исследователи ввели генетические ножницы CRISPR-Cas в покоящиеся CD4+ клетки, что позволило им вносить целевые изменения в геном клеток-хозяев - например, устранять гены с помощью так называемых нокаутов. "Эта комбинация сработала очень эффективно, и мы смогли достичь и генетически манипулировать примерно 98% клеток. Более того, мы сделали это без активации CD4+ клеток", - говорит Кепплер. "Особенно интересным было то, что мы смогли одновременно устранить до шести генов с высокой эффективностью с помощью одной нуклеофекции. До этого никому не удавалось сделать это в первичных клетках, а мы сделали это с клетками, выделенными из интактного органа".
Таким образом, в будущем исследователи смогут удалять отдельные гены и целые сигнальные пути и анализировать их функции. Выбив соответствующие гены, им уже удалось выяснить, играют ли четыре ранее спорных клеточных фактора роль в ВИЧ-инфекции или нет. Кроме того, помимо нокаута, они использовали второй подход - "нок-ин", при котором вставляются дополнительные или слегка измененные гены, например, ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). С помощью этого белка исследователи могут анализировать, как изменяется активность целевого гена в определенных условиях, или помечать конкретные белки.
"Все это вместе дает нам возможность впервые исследовать взаимодействие ВИЧ с покоящимися CD4+ Т-клетками человека в физиологических условиях",
- объясняет Кепплер. "Мы также можем лучше изучить эти клетки с точки зрения их общей роли в качестве иммунных клеток".
В долгосрочной перспективе исследователи надеются, что лучшее понимание биологии этих клеток приведет к новым подходам для полного удаления ВИЧ из организма пациентов, поскольку в мире все еще насчитывается около 37 миллионов человек, инфицированных этим вирусом.
