Вклад клинической метагеномики в диагностику инфекций костей и суставов (аннотация)Вклад клинической метагеномики в диагностику инфекций костей и суставов
Инфекции костей и суставов (ИКС) являются серьезными инфекциями, поражающими все большее число пациентов.
ИКС создают значительное экономическое бремя, помимо связанной с ними заболеваемости и смертности. С точки зрения клинициста, ИКС являются сложными инфекциями, требующими точной микробиологической диагностики для подбора антимикробной терапии, которая обычно необходима в течение нескольких недель. Тем не менее, такая диагностика является сложной задачей в связи с разнообразием микроорганизмов, которые могут быть вовлечены в ИКС: аэробные/анаэробные бактерии, прихотливые бактерии (например, Mycoplasma), грибы и/или микобактерии (Hogan et al., 2019). Согласно современным данным, примерно в 80% случаев обнаруживается один возбудитель (так называемые мономикробные инфекции), а в 10% случаев обнаруживается более одного микроорганизма (полимикробные инфекции). Между тем, частота культурально-отрицательных ИКС колеблется от 5 до 35% (Tande and Patel, 2014).
В настоящее время рутинная диагностика ИКС в значительной степени зависит от микробиологической культуры. Учитывая разнообразие потенциально возможных микроорганизмов, используются различные наборы условий культивирования, включая различные среды, инкубационные атмосферы и время инкубации. Когда результаты культурального анализа отрицательны, а подозрение на ИКС остается высоким, могут быть использованы молекулярные методы, такие как амплификация и секвенирование гена, кодирующего 16S рРНК (секвенирование по Сэнгеру). Секвенирование 16S рДНК позволяет выявить быстрорастущие бактерии и бактерии, которые не могут расти, поскольку были убиты предыдущим воздействием антибиотиков (Fida et al., 2021), но оно плохо работает в полимикробных образцах, когда необходимо идентифицировать более одного микроорганизма. Кроме того, секвенирование 16S рДНК не дает никакой информации, связанной с резистентностью к противомикробным препаратам.
Клиническая метагеномика (КМГ) - это метагеномное секвенирование нуклеиновых кислот, выделенных из образца, который может содержать смешанные популяции микроорганизмов, для получения информации, имеющей клиническое значение. КМГ потенциально может:
(i) определить, какие микроорганизмы присутствуют,
(ii) оценить их относительное соотношение и
(iii) предоставить информацию, связанную с их чувствительностью к противомикробным препаратам.
Впервые о КМГ было сообщено в 2014 году при секвенировании образца спинномозговой жидкости, полученного от 14-летнего мальчика, страдавшего нейролептоспирозом. С тех пор этот метод доказал свою актуальность в широком спектре клинических ситуаций. При подозрении на бактериальные инфекции основным преимуществом КМГ перед традиционными методами является его способность идентифицировать:
(i) бактерии, не выявляемые обычными методами,
(ii) генетические детерминанты резистентности к противомикробным препаратам и
(iii) другие представляющие интерес гены, такие как гены, кодирующие факторы вирулентности.
В шести исследованиях (Ruppé et al., 2017; Street et al., 2017; Ivy et al., 2018; Sanderson et al., 2018; Thoendel et al., 2018; Zhao et al., 2020) изучалась эффективность КМГ в сравнении с культуральными методами при диагностике ИКС. Чувствительность КМГ варьировала от 58% на уровне видов в полимикробных образцах до 100% в мономикробных образцах. Недавнее исследование показало 79% чувствительность КМГ по сравнению с комбинацией культура/16S рДНК секвенирование для микробиологической диагностики 182 жидкостей организма (включая 21 суставную жидкость; Gu et al., 2021). Однако данные, касающиеся сравнения КМГ и секвенирования комбинированной культуры-16S рДНК, отсутствуют.
Помимо идентификации микроорганизмов, КМГ может быть использована для вывода профиля их антимикробной чувствительности на основе метагеномных данных. В предыдущем исследовании нашей группы (Ruppé et al., 2017) мы искали гены резистентности к антибиотикам и мутации, связанные с резистентностью (например, мутации в генах, кодирующих топоизомеразы, связанные с резистентностью к хинолонам), и пытались сделать вывод о глобальном (на уровне образца) фенотипе восприимчивости к антибиотикам. Правильный уровень чувствительности к антибиотикам был определен в 94 и 77% мономикробных и полимикробных образцов, соответственно (Ruppé et al., 2017).
Важной проблемой в КМГ является работа с ДНК человека. В образцах, взятых из различных мест тела, выделение микробной ДНК конкурирует с выделением ДНК человека. Однако конкуренция носит необъективный характер, поскольку ДНК человека примерно в 1000 раз длиннее, чем размер среднего бактериального генома. Поэтому были предложены решения по истощению ДНК человека перед секвенированием, например, использование специфического лизиса эукариотических клеток перед экстракцией ДНК с последующим удалением свободной ДНК. Тем не менее, эта стратегия ставится под угрозу из-за циклов охлаждения и оттаивания, которые способствуют лизису микробных клеток. В предыдущем исследовании мы действительно получили минимальное количество бактериальной ДНК, необходимое для секвенирования, только для 24 из 179 образцов ИКС, которые подвергались циклам охлаждения и оттаивания.
В данном исследовании мы стремились сравнить КМГ с комбинацией культивирования и секвенирования 16S рДНК, применяемой к не замороженным образцам. Дополнительной целью было проведение секвенирования нескольких образцов для каждого пациента и рассмотрение общих результатов для оценки потенциальной добавленной ценности КМГ по сравнению с традиционными методами. В настоящем исследовании мы проверили эффективность КМГ у 34 пациентов (94 образца) с подозрением на ИКС по сравнению с культурой и секвенированием 16S рДНК.
В общей сложности 94 образца от 34 пациентов с подозрением на ИКС, набранных из двух мест, были проанализированы:
(i) традиционной культурой,
(ii) секвенированием 16S рДНК (метод Сэнгера) и
(iii) КМГ (технология Illumina).
Два отрицательных контроля также были секвенированы методом КМГ для оценки контаминации.
На основании результатов секвенирования отрицательных контролей 414 из 539 (76,7%) видов бактерий, обнаруженных с помощью КМГ, были признаны контаминантами, а 125 (23,2%) - действительно присутствующими. При мономикробных инфекциях (13 пациентов) чувствительность КМГ составила 83,3% по сравнению с культурой и 100% по сравнению с 16S рДНК. При полимикробных инфекциях (13 пациентов) чувствительность КМГ составила 50% по сравнению с культурой и 100% по сравнению с 16S рДНК. В образцах, отрицательных по культуре (8 пациентов, 21 образец), КМГ обнаружила 11 бактерий в 10 образцах от 5 разных пациентов. У 5/34 пациентов КМГ позволила поставить микробиологический диагноз, когда обычные методы не помогли, а у 16/34 пациентов КМГ предоставила дополнительную информацию. Наконец, у 24 пациентов (56 образцов) было обнаружено 99 генов резистентности к антибиотикам. При условии достаточного покрытия генома (87,5%), правильное заключение о чувствительности к антибиотикам было достигнуто у 8/8 бактерий (100%).
Таким образом, наше исследование продемонстрировало, что КМГ предоставляет дополнительные и потенциально ценные данные к традиционным методам диагностики ИКС.
