В последнее время многие исследователи сосредоточились на поиске биомаркеров хозяина для диагностики туберкулеза.
Иммунные реакции хозяина на инфекцию Mycobacterium tuberculosis (Mtb) оставляют отслеживаемые сигналы в организме хозяина, которые могут оказаться ценными для точной диагностики и/или прогноза туберкулеза (ТБ). Все чаще исследователи подтверждают возможность и точность использования протеомных сигнатур для диагностики и прогнозирования ТБ. Например, наша группа ранее провела скрининг и валидацию ключевых протеомных биомаркеров ТБ с помощью набора антител для образцов цельной крови, стимулированных пулом пептидов Mtb (ESAT-6 и CFP-10 производные пептиды) (Chen et al., 2009) или митогеном, и мы успешно идентифицировали восьмибелковую биосигнатуру, включающую I-TAC, I-309, MIG, гранулизин, FAP, MEP1B, фурин и LYVE-1. Сочетание восьми биомаркеров позволило нам отличить больных ТБ от здоровых людей из контрольной когорты со специфичностью и чувствительностью 83% (95% ДИ, 71-91%) и 76% (95% ДИ, 56-90%), соответственно (Yang et al., 2020).
В данном обзоре мы обобщаем исследовательские подходы в области протеомики, применявшиеся в течение последних нескольких лет, уделяя особое внимание прогрессу в обнаружении биомаркеров туберкулеза с помощью протеомики, в надежде получить более перспективные открытия биомаркеров для быстрой и точной диагностики туберкулеза.
Подходы к исследованию протеомики
Протеомика - это систематическое изучение протеома с целью выявления природы сложных сетей взаимодействия белков в отношении экспрессии, структуры, функции и контроля биологических процессов в организме. Сравнивая различные паттерны в протеоме, протеомика продолжает оставаться мощным методом изучения изменений в разнообразии белков, сопровождающих процессы здоровья и болезни, что делает возможным клиническую диагностику, прогноз и даже лечение различных заболеваний.
Развитие технологий и информатики делает новую концепцию достижимой, как это происходит в случае с протеомикой. Однако протеом конкретного типа клеток или ткани представляет собой смесь всех экспрессируемых белков, поэтому разделение белков является необходимым условием для анализа одного белка. Еще в 1975 году двумерный полиакриламидный гель-электрофорез (2D-PAGE), который разделяет белки на основе их размера и поверхностного заряда, был впервые применен для разделения рибосомальных белков Escherichia coli. Масс-спектрометрия (МС), которая обычно применяется для идентификации отдельных белковых пятен, разделенных 2D-PAGE, была впервые описана в 1899 году. Однако широкое применение МС стало возможным только после разработки неразрушающих методов ионизации крупных биомолекул, включая матрично-ассистированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI) и ионизацию электрораспылением. Подходы пептидного масс-фингерпринта и изотопно-кодированной аффинной метки были затем объединены с различными стратегиями МС для точного количественного определения совпадающих пептидов из белков, которые встречаются в изобилии или даже в следовых количествах в сложных смесях.
Благодаря быстрому развитию технологий в 21 веке некоторые классические технологии способствовали дальнейшей революции в протеомике. Например, 2D-PAGE и МС были развиты в такие методы, как 2D-электрофорез на дифференциальном геле, МС с поверхностно-усиленной лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), количественное химическое сшивание с МС и методы иммунодеплеции для определения белков с "низким содержанием". Кроме того, были разработаны "белковые чипы", которые сочетаются с методами МС для специфического анализа отдельных белков.
Важно учитывать, что в сочетании с протеомными технологиями базы данных протеомики, включая Swiss-Prot, Entrez и Human Proteome Organization, также продолжают вносить свой вклад в развитие протеомики. Более того, в дополнение к другим подходам, используемым в изучении единичных клеток, протеомика единичных клеток становится способом идентификации и количественной оценки белков в отдельных клетках. Хотя пока еще не существует высокопроизводительных протеомных "секвенсоров", считается, что в будущем эта технология будет способствовать открытию новых аспектов белковой и клеточной биологии.
Диагностическое применение протеомных биомаркеров туберкулеза
При инфицировании Mtb реакция клеток хозяина заключается в выработке и секреции определенных эффекторов для борьбы с вторгшимися бактериями. Кровь является основным транспортным средством для переноса эффекторов хозяина или факторов Mtb и обычно регулярно берется для клинических анализов, что делает образцы крови легкодоступными для исследовательских целей и диагностических тестов. Последние достижения в области протеомики делают возможным одновременное обнаружение тысяч белков, облегчая захват эффекторов и, таким образом, прокладывая путь для альтернативного и эффективного обнаружения биомаркеров ТБ. В данном разделе мы обобщаем последние достижения в выявлении протеомных биомаркеров, которые могут быть использованы для дифференциации ТБ от здоровых людей или людей с иным статусом заболевания. Это было достигнуто путем классификации происхождения биомаркеров из образцов крови, мочи или других типов жидкостей человеческого организма.
Выявление биомаркеров туберкулеза в образцах крови человека
Человеческая кровь и производные образцы являются идеальными для диагностики туберкулеза с точки зрения удобства, выполнимости и количества образца, который можно собрать. Кроме того, при инфекции Mtb молекулы, выделяемые в ходе иммунного ответа хозяина, такие как цитокины, в основном доставляются через кровь. Преимущества образцов крови делают их приоритетным выбором, и большинство исследований протеомных биомаркеров для диагностики ТБ основаны на образцах крови. Некоторые биомаркеры, например, ESAT6, IP-10 и CD161, выделяются либо Mtb, либо хозяином и были проверены и подтверждены для обнаружения Mtb и диагностики ТБ. Однако из-за низкой вероятности обнаружения следов Mtb в образцах крови и несоответствия результатов различных исследований, необходимы более интенсивные исследования в поисках новых потенциальных биомаркеров для диагностики ТБ.
Agranoff et al. (2006) провели исследование с целью отличить инфицированных ТБ от контрольных лиц, используя SELDI-TOF МС для поиска протеомных биомаркеров в образцах сыворотки крови. На первом этапе исследования они набрали 349 человек и изучили 179 подтвержденных культурально-положительных образцов ТБ и 170 контрольных образцов, собранных в больнице Святого Георгия (Великобритания), Анголе, Гамбии и Уганде. После профилирования всех образцов сыворотки крови с помощью массивов протеиновых чипов со слабым катионным обменом (CM10) и методов классификации машинного обучения под наблюдением, авторы использовали классификатор опорных векторов с гауссовым ядром для дискриминации протеомного профиля пациентов с активным ТБ от контрольной группы, при этом чувствительность диагностики составила 93,5%, специфичность - 94,9%, а общая диагностическая точность - 94% как лучший дискриминатор для групп ТБ и контроля.
Второй независимый и проспективно собранный набор тестов, включавший 41 валидный образец (18 образцов ТБ и 23 контрольных), обеспечил чувствительность 88,9% и специфичность 77,2%. Это исследование было надежным, но не прояснило идентичность потенциальных белковых биомаркеров, что затруднило их последующее применение в других сериях образцов. Кроме того, размер второго тестового блока был ограничен, и больший набор тестовых образцов обеспечил бы более точную валидацию.
В другом исследовании (De Groote et al., 2017b) сообщается о проведении крупного многоцентрового исследования, направленного на поиск диагностической сигнатуры белков сыворотки крови для легочного туберкулеза. Используя 4000-плексный метод анализа SOMAscan, они провели углубленный протеомный анализ 1470 образцов сыворотки крови из семи эндемичных по туберкулезу стран: ЮАР, Перу, Зимбабве, Уганды, Вьетнама, Колумбии и Бангладеш. В общей сложности 504 образца (252 без ТБ и 252 с ТБ) были протестированы на SOMAscan для обнаружения биомаркеров.
Выявленная модель HR6 маркеров реакции хозяина, включающая SYWC, каллистатин, комплемент C9, гельсолин, тестикан-2 и альдолазу C, была протестирована на слепом тестовом наборе из 204 образцов и достигла площади под кривой (AUC) 0,87 (95% ДИ, 0,81-0,91). Помимо выявленной белковой сигнатуры HR6, в данном исследовании также было обнаружено несколько ранее описанных маркеров ТБ, таких как IP-10, LBP, FCG3B и TSP4. Причиной того, что IP-10 и другие известные маркеры не были включены в сигнатуру HR6, могут быть примененные статистические методы или другие причины. Несмотря на заявления о том, что 4 000-плексный метод анализа SOMAscan способен одновременно измерять > 4 000 белков в образцах сыворотки, многие другие белки, а значит и другие более перспективные биомаркеры, могли быть пропущены.
Коинфекция туберкулеза является основной причиной смерти среди людей, живущих с ВИЧ, и для снижения смертности необходимо найти диагностические биомаркеры среди этой группы людей. Singer et al. (2021) проанализировали и сравнили белки-хозяева плазмы крови людей из Южной Африки (n = 30, представляющей регион с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом) и США (n = 24, представляющей регион с низким уровнем заболеваемости туберкулезом), и выявили, что CD14, A2GL, NID1, SCTM1 и A1AG1 совпадают в обеих когортах. Авторы далее оценили диагностическую эффективность этих белков-хозяев с помощью перекрестной валидации и обнаружили, что панели из 5-12 белков имели отличную точность 0-6 (AUC 0,93) при 6-12 месяцах (AUC 0,86) до диагностики ТБ для южноафриканской когорты и хорошую точность 0-6 (AUC 0,74) при 6-12 месяцах (AUC 0,76) до диагностики ТБ для когорты США. Кроме того, Shen и др. (2020) проанализировали 200 образцов плазмы ВИЧ-положительных пациентов с помощью протеомики на основе МС, не зависящей от данных, и сообщили, что в комбинации белки-маркеры AMACR, LDHB и RAP1B могут служить маркерами ТБ для ВИЧ-инфицированных пациентов.
В целом, диагностика ТБ у пациентов с коинфекцией ВИЧ затруднена из-за вмешательства ВИЧ-инфекции. Для получения точных и согласованных данных необходимы интенсивные исследования больших когорт с различным генетическим фоном.
В последнее время все большее число исследований сообщает о новых протеомных биомаркерах для диагностики ТБ с использованием образцов крови, мочи или других жидкостей организма. Следует отметить, что между результатами различных исследований существуют расхождения, даже среди аналогичных исследований. Кроме того, большинство протеомных биомаркеров, идентифицированных в различных образцах биологических жидкостей, были получены в ходе предварительных исследований, и предстоит еще долгий путь, прежде чем эти потенциальные биомаркеры смогут быть применены в клинической диагностике. Более того, из-за внутриклеточного существования и других особенностей адаптации бактерии, лишь немногие исследования выявили протеомные биомаркеры микобактерий, которые могут быть использованы в диагностике активного ТБ (Hendrickson et al., 2000; Chen et al., 2018).
Выявление биомаркеров туберкулеза в образцах мочи человека
Помимо образцов крови, образцы мочи являются еще одним распространенным выбором для выявления протеомных биомаркеров для диагностики туберкулеза у человека, и о некоторых соответствующих исследованиях уже сообщалось. В 2021 году Liu et al. (2021a) проанализировали и сравнили протеомные профили мочи больных туберкулезом и здоровых людей. Сначала они провели скрининг потенциальных биомаркеров с помощью метода жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) на 20 образцах больных туберкулезом и 20 образцах здорового контроля, а затем подтвердили выявленные протеомные биомаркеры еще на 52 образцах больных туберкулезом, 52 образцах латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ) и 52 образцах здорового контроля.
На основании полученных данных они пришли к выводу, что комбинация глутатионпероксидазы 3 (P22352), нейротримина (Q9P121), рецептора полиовируса (P15151), молекулы активации сигнальных лимфоцитов семейства 1 (Q13291) и гемицентина-2 (Q8NDA2) потенциально может быть использована для диагностики ТБ, с чувствительностью 82,7% для диагностики ТБ и специфичностью 92,3% для диагностики ТБ в категории ЛТБИ. Сравнивая образцы мочи 21 больного активным ТБ, 24 больных ЛТБИ и 18 здоровых контрольных групп с помощью ЖХ-МС/МС, Young et al. определили IGKC, RBP4, PTGDS, AMBP, ORM1, IGCL2 и SECTM1 как потенциальные белковые биомаркеры для дифференциации ТБ от ЛТБИ или здоровых контрольных образцов. Однако они не подтвердили эту группу биомаркеров во второй когорте и не уточнили диагностическую чувствительность или специфичность (Young et al., 2014). Кроме того, в образцах мочи пациентов из Зимбабве была выявлена уникальная 21-мерная пептидная последовательность Mtb (VVLGLTVPGGVELLPGVALPR) (Pollock et al., 2018), которая показала 95% гомологию последовательности с оксидоредуктазой Mtb (MRGA423_21210) из клинического изолята MTB423 (выявленного в Керале, Индия), однако значимость этого случайно выявленного биомаркера Mtb-оригинального белка требует проверки в дальнейших исследованиях.
Выявление биомаркеров туберкулеза в других биологических жидкостях человека
Слюна и мокрота, которые содержат тысячи белков, мРНК и видов бактерий, широко используются для изучения биомаркеров и в качестве образцов для диагностики и оценки заболевания. Сбор образца слюны/мокроты прост, неинвазивен и более приемлем для повторного тестирования. Несколько биомаркеров для диагностики ТБ были выявлены в слюне с помощью протеомических методов. Недавно P01011, Q8NCW5, P28072, A0A2Q2TTZ9 и Q99574 были идентифицированы с помощью масс-спектрометра QExactive Orbitrap, при этом комбинированная биосигнатура из пяти белков, как было показано после перекрестной валидации, дала AUC 1. 00 (95% ДИ, 1,00-1,00), чувствительность 100% (95% ДИ, 76,2-100%) и специфичность 90,9% (95% ДИ, 58,7-99,8%) при диагностике ТБ (Mutavhatsindi et al., 2021).
С помощью МС было подтверждено, что сигнатура, включающая β-интегрин, витамин D-связывающий белок, утероглобин, профилин и антимикробный пептид кателицидин в слюне, позволяет отличить пациентов с активным туберкулезом от пациентов без туберкулеза с AUC 0,75 (Bishwal et al., 2019). Mariam и коллеги исследовали протеом мокроты пациентов с активными и латентными инфекциями ТБ, а также контролей, используя сверхбыстрый подход к подготовке образцов. С помощью 49 белковых сигнатур удалось успешно отличить больных ТБ от контрольных лиц; однако эта панель белков не смогла отличить ЛТБИ от здоровых людей.
В другом исследовании протеомный анализ слюны показал, что у больных ТБ наблюдается специфическое накопление белков, связанных с активацией комплемента, воспалением и модуляцией иммунного ответа, и снижение белков, связанных с метаболизмом глюкозы и липидов. Группа белков, включая гаптоглобин, альфа-1-кислый гликопротеин 1 и 2, иммуноглобулин гамма 4 цепи, фибриногены, дермцидин, изомераза дисульфида белка, изомераза триозофосфата и ras GTPase-activating-like protein, являются другими потенциальными биомаркерами для диагностики ТБ (Mateos et al., 2019).
Проблемы и перспективы на будущее
Интенсивные исследования взаимодействия Mtb с хозяином расширили и углубили наши знания о стратегиях, применяемых Mtb для заражения хозяев, и о реакции хозяина на инфекцию. Развитие технологий, особенно МС, способствовало выявлению протеомных биомаркеров с высокой эффективностью, но все еще существуют некоторые технические проблемы, замедляющие применение протеомики для диагностики активного ТБ.Сложности отбора образцов (например, время сбора образцов, интерференция мелких молекул и сосуществование ТБ с другими типами заболеваний), различия в количестве белков, наличие изоформ и посттрансляционных модификаций являются барьерами, препятствующими выявлению точных и универсальных биомаркеров с помощью существующих технологий и стратегий.
Потребуются более мощные методы с улучшенной чувствительностью, особенно для белков с низким содержанием, а также для дифференциации изоформ и модификаций белков. Кроме того, существует риск диагностической погрешности при использовании одного белкового биомаркера, а группа биомаркеров в рамках панели может быть определена одновременно с помощью современных технологий, однако расхождения между различными отчетами увеличиваются, предоставляя путаные или даже вводящие в заблуждение данные для оптимальных маркеров диагностики ТБ.
Одной из причин неудовлетворительной воспроизводимости обнаруженных биомаркеров является то, что исследованные когорты различаются по геномному фону, иммунным реакциям или другим факторам. Для преодоления этой проблемы могут потребоваться большие когорты образцов из различных популяций, включающие разнообразные статусы пациентов с ТБ. Более того, сочетание различных "омических" методов может быть полезным для повышения точности и согласованности диагностики ТБ, а протеомика единичных клеток особенно перспективна как метод, который в будущем будет способствовать диагностике активного ТБ.
