Staphylococcus aureus является основной причиной костно-суставных инфекций (КСИ) и вызывает трудно поддающиеся лечению инфекции, связанные с несколькими механизмами персистенции.
В частности, его способность сохраняться в фагоцитирующих костных клетках ослабляет иммунную систему хозяина и действие большинства антимикробных препаратов. Следовательно, способность антимикробных препаратов уничтожать внутриклеточный резервуар S. aureus может оказать значительное влияние на риск хронического течения КСИ и возникновение рецидивов.
Было показано, что S. aureus сохраняется внутри фагоцитов благодаря фаголизосомальной репликации и выходу в цитоплазму. Он также заметно влияет на аутофагию, часть врожденного иммунного ответа против бактериальных инфекций, соответствующую катаболическому процессу, ведущему к образованию аутофагосомы - комплекса, заключающего внутрицитоплазматические бактерии. В этом процессе участвуют SQSTM1/p62 (секвестосома 1), убиквитиновый рецептор, необходимый для селективной деградации, и LC3, мембранный белок, участвующий в удлинении и созревании фагосом. Для уничтожения внутриклеточных бактерий аутофагосома и лизосома сливаются, образуя аутолизосому - гибридную органеллу с кислой средой.
Интересно, что ухудшение внутриклеточной антимикробной активности связано с плохим проникновением некоторых молекул в клетки, их низким распределением в субклеточном местообитании S. aureus и внутриклеточным появлением вариантов малых колоний (SCVs), а также с инактивацией препаратов кислым pH внутриклеточных органелл. Поэтому в некоторых исследованиях рассматривалось подщелачивание лизосом для восстановления внутриклеточной антибиотической активности. Оказалось, что ощелачивание также предотвращает появление SCV.
Таким образом, лизосомотропные алкалинизирующие агенты могут способствовать воздействию на интраостеобластный резервуар S. aureus при КСИ. Настоящее исследование представляет собой первую оценку различных лизосомотропных алкалинизирующих агентов, используемых в качестве адъювантов к традиционным антистафилококковым препаратам в модели остеобластной инфекции in vitro.
Проведенные предварительные эксперименты позволили нам установить наилучшие условия для доказательства концепции ощелачивания в нашей модели. Во-первых, определение МИК при pH 5 и 7 подтвердило, что низкий лизосомальный pH может снижать активность многих антимикробных препаратов. Под влиянием кислого рН и будучи наиболее назначаемыми при КСИ антимикробными препаратами, даптомицин, котримоксазол, клиндамицин и левофлоксацин были выбраны для дальнейшей оценки в модели инфекции остеобластов.
Во-вторых, на основании его высокого ощелачивающего потенциала при низкой цитотоксичности при протестированной концентрации и времени экспозиции, гидроксихлорохин был выбран как лучший адъювант для тестирования в комбинации с антибиотиками. Действительно, после 24 часов инкубации в концентрации 20 мг/л гидроксихлорохин позволил повысить рН лизосом с 4,8 до 7,0. Аналогично, Maurin et al. сообщили о повышении лизосомального рН с 4,8 до 5,3, 5,7 и 6,8 в мышиной модели исследования макрофагов с использованием амантадина (1 мг/л), хлорохина (1 мг/л) и хлорида аммония (1 мг/мл) (13).
Что касается влияния ощелачивания лизосом, то добавление гидроксихлорохина к антимикробным препаратам позволило значительно усилить их бактерицидное действие без межштаммовой вариабельности. В литературе мало данных о потенцировании антибиотиков ощелачивающими агентами для внутриклеточного уничтожения S. aureus. Наши результаты дополняют предварительные результаты, показавшие, что хлорохин (1 мг/л), ассоциированный с амикацином, увеличивал снижение интрамакрофагиальной инокуляции S. aureus. Кроме того, используя эпителиальные клетки легких человека, Leimer и др. показали, что флуклоксациллин, ассоциированный с хлорохином, значительно снижает долю внутриклеточных SCVs. В совокупности эти данные поддерживают использование этой адъювантной терапии против интрацеллюлярных S. aureus.
С другой стороны, некоторые антимикробные препараты с повышенной активностью при кислом pH могут быть ослаблены щелочной терапией. В частности, наблюдалось 8-42-кратное увеличение МИК рифампина при рН 7 по сравнению с рН 5, что может представлять собой существенное ограничение использования подщелачивающих стратегий, учитывая решающую роль рифампина в исходе инфекций, ассоциированных с ортопедическими процедурами. Однако МИК рифампина, оцененные при нейтральном pH, остаются намного ниже внутрикостных концентраций, достигаемых при использовании стандартных терапевтических доз. Кроме того, в качестве альтернативы могут быть предложены другие рифамицины, особенно рифабутин, который теоретически может выиграть от ощелачивания и проявить более высокую антибиопленочную и интрацеллюлярную активность.
Наконец, мы показали, что потенцирование антимикробной активности, связанное с ощелачиванием лизосом, было не единственным механизмом воздействия гидроксихлорохина на интрацеллюлярный резервуар стафилококков. Действительно, несмотря на отсутствие собственной антибактериальной активности, гидроксихлорохин сам по себе был способен значительно снизить внутриклеточную инокуляцию S. aureus. Сообщается, что гидроксихлорохин взаимодействует с аутофагическими процессами, в основном в онкологии. Наблюдаемое увеличение LC3-II, начиная с самых низких концентраций гидроксихлорохина, свидетельствует в пользу индукции аутофагии. Кроме того, слабое накопление SQSTM1 свидетельствует в пользу одновременного ингибирования образования фаголизосом, как описано для других типов клеток.
Поскольку гидроксихлорохин улучшал эрадикацию внутриклеточных бактерий, начиная с 2,5 мг/л, но усиливал антимикробную активность только с 10 мг/л, мы предположили комбинированный эффект индукции аутофагии при низких концентрациях, а затем антимикробного потенцирования путем ощелачивания лизосом при более высоких концентрациях. Следует отметить, что если гидроксихлорохин сам по себе вызывал значительное снижение внутриклеточного инокулята при низких концентрациях, он не мог предотвратить цитотоксичность, вызванную инфекцией.
Этот парадоксальный результат может быть обусловлен отсутствием внутреннего влияния гидроксихлорохина на рост бактерий и выделение токсинов. Наконец, обычная позология гидроксихлорохина в качестве пожизненного лечения ревматоидного артрита и красной волчанки составляет 400-800 мг/день, обеспечивая концентрацию в крови от 1 до 2,5 мг/л. Использование более высоких суточных доз - даже более коротких по продолжительности - во время лечения КСИ для улучшения эрадикации внутриклеточных бактерий, вероятно, невозможно из-за проблем с переносимостью. Тем не менее, настоящие данные представляют собой доказательство концепции на клеточной модели, и другие лизосомотропные агенты, такие как Lys05, новый 4-аминохинолин с улучшенной способностью накапливаться в лизосомах, могут обладать более мощным ощелачивающим эффектом и быть альтернативой гидроксихлорохину.
В заключение следует отметить, что гидроксихлорохин в качестве адъюванта к антимикробным препаратам может улучшить эрадикацию внутрикостного резервуара S. aureus за счет восстановления внутриклеточной активности некоторых антимикробных препаратов и препятствования бактериальному нарушению аутофагии. Эта новая клиническая перспектива требует теперь in vivo подтверждения ее эффективности и токсичности.
