Понимание того, как микробные белки влияют на организм хозяина, может дать более глубокое представление о перекрестном взаимодействии микробиоты кишечника и хозяина.
Микробиота кишечника может регулировать физиологию и патофизиологию хозяина, вырабатывая ферменты с функциями, аналогичными функциям хозяина. Однако выявление таких изоферментов на основе секвенирования затруднено, поскольку ферменты со сходными функциями у разных видов могут не сохранять последовательности. Для обнаружения и характеристики таких изоферментов микроорганизмов хозяев более надежной является система функционального скрининга белков на основе их активности, что позволит получить более глубокие представления о перекрестном взаимодействии микробиоты кишечника и хозяина.
Методы
Для выявления потенциальных изоферментов микроорганизмов хозяев мы создали платформу скрининга активности ферментов, включающую анализ активности 110 ферментов, функционирующих при различных заболеваниях человека. Активность этих ферментов измерялась в бактериальных сообществах, полученных ex vivo из образцов кала. Дипептидилпептидаза 4 (DPP4) была одним из основных изоферментов, выявленных в ходе нашего анализа, но мало что известно о ее патофизиологических эффектах на хозяина. Мы попытались определить, может ли DPP4, продуцируемая микроорганизмами кишечника, подобно DPP4 хозяина (hDPP4), снижать уровень активного GLP-1 (глюкаго́ноподо́бный пепти́д-1, ГПП-1, энтероглюкагон — пептидный гормон из семейства инкретина, вырабатывается в кишечнике в ответ на приём пищи - прим.пер.) и, таким образом, влиять на гомеостаз глюкозы в крови.
Результаты
С помощью нашей платформы скрининга активности ферментов мы выявили 71 фермент с положительной активностью в сообществах бактерий кишечника человека, большинство из которых были подтверждены в белковых экстрактах, полученных из фекалий мышей, свободных от микробов и специфических патогенов. Среди выявленных ферментов активность DPP4 имела наибольший статистический эффект среди 10 образцов, полученных от человека.
В результате выделения бактерий кишечника человека и скрининга активности DPP4 мы обнаружили, что микробный DPP4 продуцируется в основном Bacteroides spp. Кишечный микробный DPP4 (mDPP4) может разрушать активный GLP-1 in vitro. Однако mDPP4 не влиял на уровень активного GLP-1 у мышей, получавших обычный корм, но снижал активность активного GLP-1 и нарушал гомеостаз глюкозы у мышей, получавших корм с высоким содержанием жиров (HFD) или декстрансульфат натрия/индометацин, что свидетельствует о том, что для влияния mDPP4 на активность GLP-1 хозяина требуется повреждение кишечного барьера.
Мы обнаружили, что клинический ингибитор DPP4 ситаглиптин не способен эффективно ингибировать mDPP4. В результате анализа ко-кристалла mDPP4 с ситаглиптином с разрешением 1,97 анстрема были обнаружены различия в характере связывания препарата с mDPP4 по сравнению с его связыванием с hDPP4, что может объяснить такое различие в ингибирующем действии. Клиническое исследование ситаглиптина среди пациентов с сахарным диабетом 2-го типа (Т2Д) (n = 57) и соответствующая трансплантация фекальной микробиоты стула от высоко- и низкореспонсивных пациентов в настоящем исследовании мышам, питающимся HFD, показали, что mDPP4 может ограничивать эффективность ситаглиптина у лиц с Т2Д и у мышей с непереносимостью глюкозы.
Для поиска селективного ингибитора mDPP4 мы проанализировали ~107 тыс. соединений и с помощью структурной модификации выявили Dau-d4, производное дауризолина, которое способно селективно ингибировать активность mDPP4 по сравнению с hDPP4. Dau-d4 повышал уровень активного GLP-1 и улучшал метаболизм глюкозы у мышей-диабетиков, а совместное применение Dau-d4 с ситаглиптином еще больше улучшало гомеостаз глюкозы в крови.
Выводы
В данной работе мы разработали стратегию идентификации неохарактеризованных изоферментов микроорганизмов кишечника и хозяина, которая позволяет глубже понять взаимодействие микробиоты кишечника и хозяина. Изофермент DPP4 микроорганизмов кишечника может нарушать гомеостаз глюкозы в организме хозяина, а различия в активности DPP4 микроорганизмов, возможно, способствуют гетерогенному ответу на ситаглиптин, наблюдаемому у пациентов с Т2Д.
Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности разработки терапии, направленной на ферменты как хозяина, так и микроорганизмов кишечника, для достижения большей клинической эффективности.
Открытие и ингибирование изофермента, регулирующего метаболизм микроорганизмов кишечника и хозяина.
Различия в микробиоте кишечника могут объяснить, почему одни люди отвечают на антидиабетические ингибиторы DPP4, а другие - нет. С помощью системы скрининга активности ферментов были выявлены изоферменты DPP4 микроорганизмов кишечника, которые могут снижать уровень активного GLP-1, но не могут быть ингибированы ситаглиптином. Высокопроизводительный скрининг выявил Dau-d4 в качестве селективного ингибитора микробного DPP4 для повышения активности GLP-1 и улучшения толерантности к глюкозе.
