Исследователи обнаружили, как белки вирулентных бактерий вымывают питательные вещества из клеток растений, что позволило создать потенциальный метод лечения больных растительных культур.
Используя микроскопический шприц из белка, бактерии вводят в клетки растений целый арсенал вирулентных белков, вызывающих заболевания и уничтожающих урожай. Микробиологи, работающие в Университете Дьюка, изучают эти белки в надежде найти препараты, способные защитить растения от их нападения. В своей работе, опубликованной в журнале Nature, Шенг Ян Хе и его коллеги раскрыли структуру и функции большого семейства вирулентных белков, которые не удавалось обнаружить ученым в течение четверти века. Эта информация помогла исследователям разработать новый метод лечения болезней сельскохозяйственных культур.
Среди множества вирулентных белков, которые бактерии вводят в клетки растений, есть белок авирулентности E (AvrE) и его родственники. "Этот белок известен уже 25 лет, и люди пытались работать с ним, но он очень большой, и его размер затрудняет его изучение", - рассказал Джефф Дангл, иммунолог растений из Университета Северной Каролины, который не принимал участия в работе. "Более того", - отметил он, - "он фактически токсичен для растений, дрожжей, животных клеток - любых клеток, с которыми он соприкасается". Это затрудняет проведение экспериментов по изучению функций белков.
Структура этих белков в значительной степени сохраняется у разных видов бактерий, что делает их идеальными мишенями для новых лекарственных препаратов, поэтому Хе и его коллеги решили раскрыть их функции. Сначала группа расшифровала структуру AvrE и его родственников. Структурный анализ крупных белков затруднен только экспериментальными методами, поэтому они обратились к программе машинного обучения AlphaFold2.
Команда обнаружила, что четыре родственных белка из разных видов бактерий имеют схожую форму, каждый из них несет полый ствол, что позволяет предположить, что они могут вести себя как транспортные каналы, если встраиваются в клеточную мембрану. "Одним из ключевых открытий в этой истории стало использование AlphaFold для предсказания структуры, что позволило авторам сразу же выдвинуть гипотезу, поскольку предсказанная структура предполагала четкую функцию", - отметил Дангл.
Чтобы выяснить, осуществляют ли эти каналы транспорт ионов, Хе и его коллеги ввели в яйца лягушек мРНК, кодирующую два вирулентных белка. Лягушачьи яйца являются удобной моделью для изучения электрических токов, индуцированных транспортом ионов через клеточные мембраны, поскольку они обладают меньшим количеством собственных ионных каналов, чем большинство типов клеток, и, следовательно, создают меньший фоновый сигнал.
Авторы обнаружили, что белки вирулентности вызывают электрический ток через мембрану при подаче напряжения, что свидетельствует о том, что каналы располагаются внутри мембраны и позволяют ионам свободно проходить через их полые стволы. По совпадению, они также заметили набухание яиц, несущих белки, и предположили, что каналы могут также транспортировать воду. Чтобы проверить это, они поместили икринки в простой водный раствор с более низкой концентрацией ионов, чем внутри икринок лягушки. В результате этого дисбаланса вода устремлялась в икринки, экспрессирующие каналы, вызывая их набухание и разрыв. Таким образом, ученые подтвердили, что каналы переносят через клеточную мембрану не только ионы, но и воду.
На основании структурного анализа исследователи предсказали, что каналы имеют отверстие шириной от 15 до 20 ангстремов (Å), что составляет примерно одну миллионную ширины соломинки. Поэтому далее исследователи проверили, могут ли каналы транспортировать сложные соединения. Крупные соединения, такие как флуоресцентные белки шириной 30 Å, не проникали в икринки лягушек, а вот более мелкие соединения, такие как флуоресцеин шириной 7 Å, проникали легко.
Большой вопрос заключается в том, какую пользу эти каналы приносят бактериям. "Бактериальные патогены живут в губчатом воздушном пространстве внутри листа, и это пространство довольно сухое, - объясняет Дангл. Бактериям для роста необходима влага, но они не могут прорвать клеточную стенку, чтобы получить прямой доступ к ресурсам растения. Поэтому они осушают окружающие клетки впитывая воду. Исследователи предположили, что эти каналы могут быть ключевыми для получения воды и питательных веществ из клеток. В будущем специалисты планируют изучить работу этих каналов внутри листа, измеряя поток флуоресцентно меченых соединений.
Наконец, ученые искали соединения, блокирующие эти каналы и ограничивающие развитие заболеваний. Для этого они обратились к полиамидоамину G1 - полимеру размером 22 Å, ширина которого превышает диаметр канала. Этот препарат оказался перспективным для использования в лягушачьих яйцах: он блокировал ионные токи, набухание и разрыв, а также поглощение флуоресцеина.
Полиамидоамин G1 успешно предотвращал заболевания и у растений. Препарат не позволил двум распространенным патогенам сельскохозяйственных культур - Erwinia amylovora и Pseudomonas syringae - вызывать симптомы заболеваний у растений, включая темные нарывы, известные как огненная пятнистость груш, и коричневые пятна (мертвые клетки) на листьях модельного растения Arabidposis thaliana. В дальнейшей работе планируется определить структуру препарата, связанного с одним из белков, чтобы выяснить, как он блокирует канал.
В лабораторных условиях препарат не подавлял рост бактерий, хотя и препятствовал развитию болезни у растений, что позволяет предположить, что он не убивает бактерии, как антибиотик, а ограничивает их вирулентность. Возможно также, что иммунная система растений очищается от инфекции под воздействием препарата; однако исследователи не обнаружили активации иммунных белков растений, что позволяет предположить, что защитный эффект сводится к ингибированию каналов. "Это будет применимо ко всем бактериальным патогенам, содержащим это семейство белков. Их много, и они являются основными патогенами", - отметил Хе. По его мнению, помимо предотвращения поражения яблонь и груш огневкой, препарат может бороться с пандемическим штаммом P. syringae, поражающим киви в Азии, Европе и Новой Зеландии.
"Я в восторге от этого исследования, в котором были применены передовые технологии структурной биологии для раскрытия давно известного механизма действия важного вирулентного белка, продуцируемого бактериальными патогенами растений", - говорит Вэньбо Ма, микробиолог из лаборатории Sainsbury, не принимавшая участия в работе, но сотрудничавшая с одним из авторов в прошлом. "Это очень уникальная мишень, которая не вырабатывается эукариотами", - отметила Ма. Препараты, воздействующие на бактериальные белки, имеющие мало сходства с белками хозяина, являются идеальным вариантом, поскольку они с меньшей вероятностью могут вызывать побочные эффекты у хозяев. "Но может ли это конкретное соединение влиять на другие неродственные белки или функции, мы не знаем, и это необходимо проверить", - добавила она.
