Быстрое получение геномной информации с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) ставит под сомнение то, как проводятся границы между видами бактерий.
В отличие от эукариот, бактерии часто не вписываются в универсальное понятие вида. Методологические и связанные с культивированием барьеры ограничивают возможность измерения разнообразия внутри бактериальных видов и между ними. Развитие технологий и доступность методов секвенирования позволили преодолеть многие из этих проблем и экспоненциально увеличить количество секвенированных бактериальных геномов. Теперь исследователи могут наблюдать генетическое разнообразие бактерий с большим разрешением.
Новые инструменты для переопределения видов
Начиная с конца 19 века, ученые различали бактерии на основе морфологии, требований к росту и патогенного потенциала. Морфология все еще широко использовалась до середины 20-го века, когда методы развивались и стали включать такие методы, как ДНК-ДНК гибридизация, биохимия и хемотаксономия. Исследователи предложили критерии для разграничения видов с помощью этих методов, но в значительной степени полагались на ранее описанные группы видов для определения этих пороговых значений. Например, исследователи определили порог в 70% ДНК-ДНК гибридизации после того, как Джонсон измерил гибридизацию между видами и внутри видов и описал "отчетливый разрыв" при 70% гомологии в 1970-х годах. Цифровая ДНК-ДНК гибридизация - метод in silico, представленный в 2010 году для оценки ДНК-ДНК гибридизации при сравнении геномов, также использует этот 70% порог.
Недавно сочетание NGS и биоинформационных инструментов для сравнения полных геномов позволило исследователям сравнивать и различать изоляты с большим разрешением. Методы NGS позволяют проводить секвенирование с высокой пропускной способностью, обеспечивая более быстрое секвенирование большего количества организмов за более короткий промежуток времени, чем традиционные методы секвенирования.
Приток геномных данных привел к реструктуризации определенных таксономических отношений, включая идею выделения трех доменов - Archaea, Bacteria и Eukarya. Со снижением стоимости секвенирования полных геномов и увеличением числа общедоступных геномов исследователи используют среднюю нуклеотидную идентичность всего генома для разграничения видов. Биоинформатики могут сравнивать геномы для определения филогенетических связей и используют эти методы в области системной биологии, целью которой является определение и описание организмов и их эволюционных связей. Несмотря на увеличение количества данных и методов измерения разнообразия и эволюционных отношений, ученые все еще спорят о том, как и где разделять бактерии на виды. Некоторые предложили универсальную границу геномного разнообразия. Например, Кьюфо и коллеги предложили порог в 96% средней нуклеотидной идентичности (ANI) двух выровненных последовательностей целых геномов в качестве оперативного определения вида. Другие исследователи пересмотрели отдельные виды и предложили разделить данные организмы на несколько видов.
Эти методы помогли пересмотреть таксономию некоторых патогенов. За последние несколько десятилетий методы молекулярной биологии привели к реклассификации клинически значимых видов, таких как Borrelia burgdorferi. Бургдорфер и др. обнаружили этиологический агент болезни Лайма в 1982 году, когда сыворотки пациентов Лайма были признаны содержащими антитела к спирохете, найденной в клещах. Подобные спирохеты были обнаружены у пациентов с острой болезнью Лайма. Джонсон и др. классифицировали этот организм как B. burgdorferi в 1984 году, после сравнения родства между этими спирохетами и другими спирохетами Borrelia, используя ДНК-ДНК гибридизацию, и обнаружив, что Лайм-ассоциированные штаммы более похожи друг на друга, чем на другие виды Borrelia.
В 1992 году Брантон с коллегами сравнили 48 изолятов, описанных как B. burgdorferi, используя ДНК-ДНК гибридизацию и другие молекулярные методы, и предположили, что среди этих штаммов было достаточно разнообразия, чтобы классифицировать их как 3 "геновида", предполагаемых таксономических групп, основанных на родстве ДНК. Они назвали геновиды, которые наиболее близко напоминали эталонные штаммы B. burgdorferi sensu stricto, и описали 3 геновида, ранее известные как B. burgdorferi, B. burgdorferi sensu lato. Термины "sensu stricto" и "sensu lato" на латыни означают "в узком смысле" и "в широком смысле", соответственно, и используются для разграничения новых и унаследованных определений названий видов. Сохранение аспекта прежней классификации поддерживает интерпретируемость, особенно в клинических условиях, где может быть трудно изменить устоявшиеся названия. Однако различия в клинических проявлениях болезни Лайма, связанных с этими 3 геновидами, демонстрируют важность точного определения патогенных бактерий. Сейчас NGS выявляет дополнительные новые виды B. burgdorferi sensu lato.
Патогенная бактерия Bacillus cereus также была переклассифицирована в несколько видов. Примерами этих видов являются патоген B. cereus sensu stricto, передающийся через пищевые продукты, и агент биотерроризма B. anthracis. NGS позволила с помощью методов полногеномного ANI выделить новые виды B. cereus sensu lato и быстро увеличить число предложенных видов B. cereus sensu lato: в период с 2013 по 2017 год было предложено 12 новых видов. В исследованиях, предложивших эти новые виды, использовались разные пороговые значения ANI, что привело к неоднозначности и возможности принадлежности изолятов к нескольким видам. Кэрролл и коллеги наблюдали за распределением ANI по всему геному и описали "естественные пробелы", где геномы кластеризовались в пределах 92,5% ANI и давали виды, в которых не было штаммов, пересекающихся в нескольких группах. Поэтому они предложили порог 92,5% ANI для видов внутри B. cereus sensu lato. Поскольку эти виды встречаются в различных средах и по-разному проявляются у пациентов, правильное разграничение и идентификация важны для правильной диагностики и лечения.
Клиническая важность точного определения видов: случай Gardnerella vaginalis
Еще один вид, имеющий клиническое значение, который ученые переоценивают, - это Gardnerella vaginalis. До недавнего времени все бактерии рода Gardnerella считались G. vaginalis, но последние исследования генетического разнообразия заставили ученых разделить G. vaginalis на несколько видов. Gardnerella spp. ассоциируются с неблагоприятными явлениями для здоровья, такими как бактериальный вагиноз и преждевременные роды, но также встречаются и в здоровых микробиомах влагалища. Леопольд, и отдельно Гарднер и Дьюкс, впервые описали G. vaginalis в 1950-х годах, используя традиционные методы, такие как микроскопия и окрашивание по Граму. Леопольд описал простатит и цервицит у пациентов, от которых она была выделена, а Гарднер и Дьюкс с помощью микроскопии выявили "клетки-подсказки" из мелких бактерий на эпителиальных клетках влагалища, что указывало на случаи вагинита.
Исследователи Gardnerella предложили несколько методов для разделения G. vaginalis на несколько групп, включая варианты последовательности конкретных генов, таких как cpn60 или ген 16S рРНК, и филогенетические клады. Ванехоутт и коллеги использовали 96% порог ANI, рекомендованный Кьюфо и коллегами, для разделения геномов G. vaginalis на 13 видов. Другая группа исследователей сравнила различные биоинформационные методы, включая аминокислотное сходство, и обнаружила, что геномы Gardnerella, которые они оценивали, можно разделить на 8-14 видов, причем 14-й вид - это дополнительный геном, не оцененный Ванехоуттом и коллегами. Этот дополнительный вид подчеркивает важность адекватной выборки для полного определения широты разнообразия таксона.
Недавние исследования показывают, что варианты Gardnerella, включая эти недавно определенные виды и варианты ампликонной последовательности гена 16S рРНК, могут способствовать несоответствиям в ассоциации Gardnerella с показателями здоровья. Если некоторые виды Gardnerella являются безобидными обитателями микробиома влагалища, в то время как другие являются факторами риска бактериального вагиноза и преждевременных родов, прежняя классификация всех Gardnerella как G. vaginalis ограничивает возможности клиницистов различать, когда присутствие Gardnerella указывает на риск для здоровья, и определять, когда необходимо вмешательство. Кроме того, если некоторые виды устойчивы к определенным методам лечения, важно, чтобы врачи могли правильно проводить скрининг и идентифицировать различные виды, чтобы назначить эффективное лечение.
Поэтому правильное разграничение и идентификация патогенных видов важны для правильной диагностики и лечения.
Остающиеся трудности в определении видов бактерий
Многие вопросы могут препятствовать поиску наиболее точных характеристик бактериальных видов и не позволяют прийти к консенсусу по универсальному определению вида. Поскольку все чаще используется полногеномный ANI, может оказаться невозможным определить единый порог ANI для всех филогенетических групп. Как отмечалось выше, порог в 92,5% превосходил общий порог в 96% для B. cereus sensu lato. Горизонтальный перенос генов еще больше усложняет возможность определения видов бактерий. В клинических условиях гены, придающие патогенные фенотипы, могут передаваться на плазмидах или другими способами горизонтального переноса генов, поэтому таксономическая принадлежность и вертикальная эволюционная история могут не указывать на наличие патогенности. Поэтому могут существовать различия в идеальных схемах наименования для клиницистов и систематиков.
Хотя правильная таксономическая классификация патогенных видов имеет клинические последствия, изменение исторической номенклатуры, используемой в медицине, может быть сложным и привести к путанице. Как отмечалось выше, определение термина для исходной группы, например Borrelia burgdorferi sensu lato или Bacillus cereus sensu lato, может прояснить, имеет ли кто-то в виду предыдущее или новое определение вида.
В конечном итоге, по мере секвенирования новых бактериальных изолятов и разработки новых методов их определения и сравнения, ученым, возможно, придется столкнуться с дополнительной реструктуризацией вновь названных видов.
