Наш кишечник является домом для бесчисленных бактерий, которые помогают нам переваривать пищу. Но что именно делают микроорганизмы, какие ферменты они вырабатывают и когда? И как бактерии метаболизируют полезные для здоровья продукты, которые помогают нам избежать болезней?
Чтобы получить ответы на эти вопросы, исследователи кафедры биосистемных наук и инженерии Цюрихского технологического института модифицировали бактерии таким образом, чтобы они работали как регистраторы информации об активности генов. Это важный шаг на пути к использованию сенсорных бактерий в медицине в будущем для таких целей, как диагностика и понимание того, какая диета подходит для конкретного человека.
Бактерии в кишечнике постоянно адаптируют экспрессию своих генов к условиям окружающей среды, которые связаны с питанием, здоровьем и болезнями. Неинвазивные измерения экспрессии бактериальных генов в кишечнике важны для понимания физиологии и патофизиологии микробиоты in vivo. Существующие методы не дают достаточной информации о транзиторных или проксимальных событиях в кишечнике без использования инвазивных подходов, которые нарушают нормальную физиологию или неприменимы в клинической практике.
Функция регистрации геномных данных разрабатывалась в течение последних нескольких лет исследователями под руководством профессора биологической инженерии Рэндалла Платта. Для этого они использовали технологию CRISPR-Cas. Чтобы использовать эту технологию для регистрации данных, исследователи не стали заниматься фрагментами ДНК вирусов, а сосредоточились на другом: механизм можно использовать таким образом, чтобы бактерии включали фрагменты своей собственной мессенджер-РНК (мРНК) в массив CRISPR. Молекулы мРНК - это план, по которому клетки производят белки. Таким образом, фрагменты мРНК могут показать, какие гены используются для создания белков для выполнения клеточных функций. Запись транскрипции путем извлечения спейсеров CRISPR из РНК (Record-seq) позволяет сконструированным бактериям непрерывно записывать историю экспрессии генов в популяции бактерий. Со временем фрагменты внутриклеточной РНК преобразуются в ДНК и интегрируются в качестве исторической записи спейсерных последовательностей в массивы CRISPR под действием интеграционного комплекса, содержащего слитный белок Cas1 обратной транскриптазы (RT-Cas1) и Cas2.
Чтобы сделать метод эффективным, ученые внедрили CRISPR-массив бактерии вида Fusicatenibacter saccharivorans в штамм Escherichia coli. Перенос включал в себя прототип фермента под названием обратная транскриптаза, который способен транскрибировать РНК в ДНК. Этот фермент также транскрибирует информацию в мРНК в форму ДНК, которая вместе с сопутствующими CRISPR-ассоциированными белками необходима для включения фрагмента ДНК в массив CRISPR. Затем исследователи ввели эти модифицированные Escherichia coli мышам, отобрали у животных образцы фекалий и выделили бактериальную ДНК, которую затем проанализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК. Последующая биоинформатическая оценка позволила им проработать массу данных и восстановить генетическую информацию фрагментов мРНК. Это позволило ученым определить неинвазивным способом, как часто кишечные бактерии производили ту или иную молекулу мРНК за время их пребывания в организме, и, таким образом, какие гены являются активными.
"Этот новый метод позволяет нам получать информацию непосредственно из кишечника, не нарушая его функций, - говорит Платт. "Метод имеет большие преимущества перед эндоскопией, которая может быть неприятной для пациентов и всегда связана с нарушением работы кишечника. Бактерии очень хорошо умеют регистрировать условия окружающей среды и адаптировать свой метаболизм к новым обстоятельствам, таким как изменение рациона питания", - объясняет Платт. В экспериментах с мышами, которым давали различную пищу, исследователи смогли показать, как бактерии адаптировали свой метаболизм к соответствующему питанию. Отчет о результатах исследования был опубликован 13 мая в журнале Science.
Исследователи хотели бы и дальше развивать этот метод, чтобы в один прекрасный день изучить пациентов, чтобы понять, как диета влияет на экосистему кишечника и как это отражается на здоровье. В будущем они надеются использовать этот метод для определения диетического статуса детей или взрослых. Кроме того, исследователи смогли распознать воспалительные реакции в кишечнике. Они вводили сенсорные бактерии мышам с воспалением кишечника, а также здоровым контрольным мышам и смогли определить специфический профиль мРНК кишечных бактерий, которые переключаются в режим воспаления.
Текущее исследование позволяет исследователям отличать два штамма бактерий друг от друга на основе индивидуальных генетических "штрих-кодов". В будущем это позволит исследовать на лабораторных животных функцию генных мутаций в бактериях и сравнивать профиль мРНК различных бактерий, например, нормальных по сравнении с мутантными. Благодаря молекулярному регистратору данных впервые можно определить этот профиль по мере прохождения бактерий через кишечник в режиме реального времени.
Другим возможным направлением было бы дальнейшее развитие системы для различения профилей РНК бактерий в тонком и толстом кишечнике. Кроме того, функция регистрации данных может быть включена в другие типы бактерий. Это открыло бы возможности для применения в экологическом мониторинге. Например, анализ почвенных бактерий с поля сельскохозяйственных культур позволил бы установить, применялись ли гербициды.
Исследователи подали патентные заявки на сам метод и на характерные профили РНК, которые являются сигнатурами определенных пищевых молекул и индикаторами здоровья кишечника. Прежде чем сенсорные бактерии можно будет использовать за пределами лаборатории - в том числе у пациентов, - ученым еще предстоит прояснить различные вопросы безопасности и законодательства, поскольку бактерии были генетически модифицированы.
"В принципе, существуют способы использования живых генетически модифицированных микроорганизмов в качестве диагностических или терапевтических агентов в медицине при соблюдении определенных условий, - объясняет Платт. Можно, например, модифицировать сенсорные бактерии таким образом, чтобы они нуждались в определенных питательных веществах и поэтому могли выжить только в кишечнике пациента. Как только эти бактерии покинут кишечник, они погибнут".
Интеграция соответствующих механизмов безопасности - это следующий шаг на пути к применению метода в медицине.
