Полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая может создавать миллиарды копий даже одного фрагмента ДНК на основе специфических последовательностей нуклеиновых кислот, является золотым стандартом для обнаружения нуклеиновых кислот патогенных микроорганизмов.
Хотя ПЦР доказала свою незаменимость в качестве метода обнаружения патогенных микроорганизмов во время эпидемии SARS-CoV-2 обработка образцов представляла собой множество проблем. Эти проблемы включали длительное время обработки образцов и проблемы с транспортировкой образцов для массового обследования населения, что, вероятно, ограничивает скорость обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов.
В противоположность, тесты в пунктах оказания медицинской помощи (point-of-care test - POCT) - это средства мгновенного обнаружения, которые могут быть полезны для быстрого выявления вирусных или бактериальных патогенов во время эпидемических вспышек. POCT имеют множество положительных характеристик, включая возможность быстрой автоматизированной обработки и высокую точность и достоверность. Кроме того, в отличие от ПЦР, данные методы обнаружения не зависят от лабораторных условий и, таким образом, имеют потенциал для широкомасштабного обнаружения.
Относительно новая технология, основанная на кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторах (CRISPR) и CRISPR-ассоциированных последовательностях (Cas), представляет собой потенциальное улучшение возможностей ПЦР. Система CRISPR-Cas наиболее известна для редактирования генов, но также было показано, что она является мощным и точным диагностическим инструментом. Было обнаружено, что системы CRISPR-Cas, включая CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a и CRISPR-Cas13a, распознают и расщепляют определенные фрагменты ДНК и РНК. В частности, CRISPR-Cas12a и CRISPR-Cas13a могут расщеплять ДНК и РНК, прилегающие к целевым последовательностям, что может быть использовано для обнаружения патогенных микроорганизмов. Несмотря на то, что эти системы являются относительно новыми, существующие диагностические тесты на основе CRISPR-Cas систем доказали свою способность определять наличие микробного генома на любой стадии инфекции, даже на ранних стадиях, когда результаты ПЦР обычно отрицательны.
Технологии CRISPR-Cas диагностики являются быстрыми и высокоспецифичными и могут быть внедрены по относительно низкой цене. Тем не менее, коммерческие диагностические наборы или приборы для CRISPR-Cas диагностики встречаются редко из-за сложности внедрения новых технологий в клиническую практику. В настоящее время соответствующие исследования технологии диагностики CRISPR-Cas ограничиваются лабораторными экспериментами. После глобальной эпидемии COVID-19 стало очевидно, что многие страны с низким и средним уровнем дохода не в состоянии производить собственные диагностические приборы, а их импорт стоит дорого и требует драгоценного времени. Поэтому для борьбы с COVID-19, а также будущими пандемиями срочно необходимы платформы для быстрого выявления нуклеиновых кислот с простыми процедурами и низкой стоимостью.
Совсем недавно исследователи адаптировали Cas13, который естественным образом нацелен на вирусную РНК в бактериях, в качестве инструмента для разрезания и редактирования человеческой РНК, а также в качестве диагностики для обнаружения присутствия вирусов, бактерий или других целей. Фермент был хорошо изучен в клетках млекопитающих и может быть направлен на определенные последовательности в РНК. Cas13 также относительно легко доставлять в клетки.
Цель данного обзора - дать представление о том, как стимулировать дальнейшее развитие, обобщив характеристики эффекторов системы CRISPR-Cas13 и описав последние исследования по ее применению для быстрого обнаружения патогенных микроорганизмов в сочетании с экстракцией нуклеиновой кислоты, изотермической амплификацией и детекцией продуктов.
К настоящему времени разработано большое количество диагностических инструментов на основе CRISPR-Cas13. Так например, исследователи объединили противовирусную активность Cas13 с его диагностической способностью - используя метод, называемый специфической высокочувствительной ферментативной репортерной разблокировкой, или SHERLOCK - для создания единой платформы CARVER, которая в конечном итоге может быть разработана для диагностики и лечения ssRNA-вирусных инфекций, включая инфекции, вызванные новыми и появляющимися вирусами.
Ключевым преимуществом этой технологии является возможность применения менее сложных приборов. Таким образом, эти методы особенно подходят для применения при эпидемических вспышках в районах с ограниченными ресурсами. Однако низкая пропускная способность может привести к низкой эффективности при детекции больших объемов образцов, таких как клинические образцы COVID-19, а также к перекрестной контаминации, что представляет собой важную клиническую проблему.
Предполагается, что сочетание системы CRISPR, инженерии, микроэлектроники и миниатюризации может повысить пропускную способность и автоматизацию обнаружения. Например, применение изотермической амплификации является прорывом по сравнению с обычной ПЦР, что повысило гибкость и предоставило новый выбор методов для обнаружения на местах. По мере развития исследований ожидается, что сочетание LAMP/RPA с CRISPR-Cas13 будет еще шире применяться для быстрого обнаружения патогенных микроорганизмов. Более того, сочетание изотермической амплификации и новейшей технологии CRISPR Cas13 значительно повышает точность и скорость обнаружения. В настоящее время прилагаются большие усилия для дальнейшего развития комбинации технологий изотермической амплификации и CRISPR Cas13 для снижения стоимости и упрощения процедур, с целью оптимизации быстрого обнаружения патогенных микроорганизмов на местах.
