В последние несколько десятилетий MALDI-ToF MS был внедрен в лаборатории общей бактериологии, что произвело революцию в идентификации бактерий, а также оказался полезным в идентификации микобактерий и антибиотикорезистентности.
Недавно мы предложили новый подход для идентификации Mycobacterium tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий (НТМ) на основе MALDI-ToF MS анализа липидов из термоинактивированных бактерий. Однако одним из узких мест в быстром обнаружении Mtb в настоящее время является неспособность различать микобактерии внутри комплекса Mtb с помощью MALDI-ToF MS на основе профилирования белков.
Действительно, комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) включает в себя членов, вызывающих туберкулез, включая адаптированные к человеку M. tuberculosis и M. africanum, а также подвиды M. bovis, M. bovis BCG, M. canettii, M. caprae, M. microti, M. mungi, M. origys, M. pinnipedii и M. suricattae, ассоциированные с животными. Члены MTBC характеризуются более чем 99,9% идентичностью на нуклеотидном уровне и идентичной последовательностью 16S рРНК.
Большинство инфекций MTBC у людей вызываются M. tuberculosis (90-95%), затем следуют M. bovis (1-2%) и M. caprae (1-2%); M. africanum более распространен в Западной Африке. Несмотря на высокий уровень сходства геномов, виды, входящие в группу MTBC, обладают различной вирулентностью, скоростью передачи, тяжестью заболевания, иммуногенностью и чувствительностью к лекарственным препаратам; M. bovis (как и другие) резистентны к пиразинамиду, основному противотуберкулезному препарату, в результате генетических мутаций в гене pncA. Инфекции человека M. canetti встречаются крайне редко, но M. bovis остается важным патогеном как для ветеринарии, так и для человека. Поэтому важно быстро и точно различать основные отдельные виды, особенно при консультировании по вопросам политики инфекционного контроля и выбора методов лечения.
Целью данного исследования было проверить и установить методику дифференциации M. tuberculosis и ключевых подвидов MTBC на основе видоспецифического профилирования липидов с использованием обычной системы MALDI-ToF MS и термически инактивированных микобактерий.
Методы
Слепое исследование проводилось с использованием 90 штаммов клинических изолятов микобактерий, включающих штаммы MTBC, субкультивированные на среде Миддлбрук 7H11, дополненной 10% ростовой добавкой OADC, и инкубированные в течение шести недель при 37°C, а также с использованием следующих 7 эталонных штаммов (M. tuberculosis H37Rv, M canettii, M. africanum, M. pinnipedii, M. caprae, M. bovis, M. bovis BCG), выращенных в тех же условиях, чтобы создать базу данных эталонных липидов и протестировать ее против 90 клинических изолятов MTBC. Культивированные микобактерии были термически инактивированы и загружены на MALDI-мишень с последующим добавлением матрицы. Получение данных проводилось в режиме положительных ионов.
Результаты
На основании идентификации четких и определенных липидных сигнатур от 7 эталонных штаммов, разработанный нами метод является быстрым (<10 минут) и дает интерпретируемые профили для всех изолятов, кроме четырех, вызванных плохой ионизацией, что дает n = 86 интерпретируемых спектров. Чувствительность и специфичность MALDI-ToF составили 94,4 (95% ДИ 86,4-98,5) и 94,4 (95% ДИ 72,7-99,9) соответственно.
Выводы
Профилирование липидов микобактерий позволяет быстро, безопасно и точно различать виды внутри MTBC. В целом, полученные нами липидные профили согласуются с данными литературы и генетической эволюцией MTBC, которые, исходя из используемой панели штаммов, можно разделить на 2 группы: Группа I: M. tuberculosis и Группа II: M. africanum, M. bovis и M. bovis BCG. Мы предлагаем рабочий процесс, представленный на рисунке, как простой и понятный способ выделения и дискриминации клинически значимых бактерий в рамках MBTC.
