В последние годы вспышки AMR-бактериальных инфекций, включая Streptococcus spp., в отношении множества антибиотиков стали серьезным кризисом не только в секторе здравоохранения, но и в сельском хозяйстве и аквакультуре.
Streptococcus spp. - грамположительные, факультативные анаэробы, неподвижные, не образующие спор, оксидазоотрицательные с α-, β- или негемолитической (γ) предрасположенностью. Streptococcus spp. классифицируются по экспрессии различных антигенов Лансфилда, обнаруженных на клеточной стенке. Группировка по Лансфилду - это традиционный метод, который подразделяет род Streptococcus на 20 групп на основании наличия полисахаридов и антигенов тейхоевой кислоты на клеточной стенке.
Среди этих групп стрептококки группы А (GAS) и стрептококки группы В (GBS) являются наиболее распространенными патогенами человека, вызывающими системные инфекции, связанные с высокой смертностью и заболеваемостью. Streptococcus pyogenes, являющийся бактерией GAS, ежегодно инфицирует не менее 700 миллионов человек со смертностью 15-30%, приводя к менингиту, синдрому токсического шока и фарингиту. Streptococcus agalactiae, бактерия GBS, которая встречается в микробиоте кишечника и урогенитального тракта человека, часто ассоциируется с инфекцией хирургических ран после кесарева сечения у беременных женщин и менингитом новорожденных. Streptococcus pneumoniae, с другой стороны, является основной причиной менингита и многих различных легочных инфекций, включая сепсис.
В отрасли аквакультуры Streptococcus iniae и S. agalactiae были определены как наиболее распространенные патогены, связанные со вспышками стрептококкоза, что привело к значительным экономическим потерям. Инфекции Streptococcus dysgalactiae подвида equisimilis и Streptococcus suis у поросят-отъемышей обычно вызывают пневмонию или менингит, что приводит к повышению уровня смертности и значительным финансовым потерям.
После открытия пенициллинорезистентного золотистого стафилококка в 1950-х годах и метициллинорезистентного S. aureus (MRSA) в 1960-х годах исследователи начали искать альтернативные противомикробные препараты. В связи с ростом AMR фаговая терапия, включающая использование литических белков фагов, таких как эндолизины, стала популярным направлением исследований в качестве жизнеспособной альтернативы антибиотикам.
Эндолизины или лизины были впервые описаны в лизатах S. aureus в начале 1960-х годов. Они представляют собой кодируемые фагами гидролазы пептидогликана, ответственные за деградацию пептидогликановой клеточной стенки для высвобождения новых потомков фага в конце литического цикла фага. Деградация пептидогликановой клеточной стенки нарушает осмотический баланс между клеточным и осмотическим давлением окружающей среды, что приводит к лизису и гибели клетки. Благодаря своей высокой специфичности в нацеливании на определенные связи в пептидогликановой клеточной стенке, эндолизины также широко используются в различных областях, например, в качестве природного антибактериального агента при консервировании продуктов питания, в качестве белкового дезинфицирующего средства узкого спектра действия и для местного применения на коже против MRSA.
В настоящее время исследователи выявили и протестировали множество эндолизинов, чтобы установить их потенциал в качестве новых антимикробных альтернатив. Однако клинические испытания эндолизинов против Streptococcus spp. не проводились из-за отсутствия исследований in vivo. Цель данного обзора - обсудить различные типы эндолизинов, нацеленных на Streptococcus spp., и их текущее применение в различных отраслях.
Источники и выделение стрептококковых эндолизинов
Стрептококковые эндолизины кодируются стрептококковыми литическими или умеренными фагами, которые естественно существуют в окружающей среде. Большинство известных стрептококковых эндолизинов были выделены и очищены непосредственно из сырого лизата фаговой культуры, проявляющей литическую активность в отношении хозяина, или из рекомбинантной Escherichia coli, экспрессирующей клонированные фаговые эндолизины, такие как эндолизин PlyC. Этот эндолизин был выделен и очищен из культуры фага C1, первого стрептококкового Podoviridae, выделенного из канализационной станции. PlyC проявлял литическую активность против стрептококков групп A (S. pyogenes), C и E с наиболее сильной киллинговой активностью против стрептококков группы A.
Пневмококковый эндолизин Pal был выделен из фракции лизата фага Dp-1, подвергнутой градиентному центрифугированию в CsCl, который проявил киллинговую активность в отношении S. pneumoniae. Фаг Dp-1 был выделен из горла пациентов с заболеваниями верхних дыхательных путей, подобно другому пневмококковому фагу Cp-1. В отличие от Pal, эндолизин, кодируемый фагом Cp-1 (Cpl-1), был выделен путем клонирования фрагмента ДНК Cp-1, который показал сходство с автолизином хозяина LytA, в E. coli, что позволило получить функциональный эндолизин против S. pneumoniae.
S. pneumoniae является одной из основных причин пневмонии, менингита и сепсиса в дыхательных путях, спинномозговой жидкости и кровотоке, соответственно. Поэтому использование очищенных эндолизинов для лечения пневмококковых инфекций оправдано в связи с тенденцией роста резистентности к антимикробным препаратам. Аналогичным образом, рекомбинантный ген эндолизина из литического фага SMP S. suis под названием LySMP, как сообщается, убивал многочисленные штаммы S. suis. Фаг SMP был выделен из носовых мазков мини-свиней Bama.
Недавно два стрептококковых эндолизина 23TH_48 и SA01_53 были выделены с помощью аналогичного подхода, когда целые фаговые ДНК сифовируса S. infantis 23TH и сифовируса S. anginosus SA01 были секвенированы, а гены эндолизинов клонированы в E. coli. Было установлено, что SA01_53 лизирует только своего хозяина-мишень, тогда как 23TH_48 обладает более широким спектром хозяев, включающим S. pneumoniae, что делает его перспективным кандидатом для лечения пневмококковых инфекций в дополнение к Cpl-1 и Pal.
Современное применение эндолизинов
Животноводство и молочная промышленность
Распространение штаммов бактерий AMR и вспышки заболеваний в животноводстве являются глобальными проблемами, которые значительно возросли в последние годы. Эндолизин изучался как альтернативный бактерицидный и консервирующий агент в попытке облегчить проблемы продовольственной безопасности. Хотя многие эндолизины были идентифицированы и широко изучены на предмет их эффективности против конкретных патогенных бактерий в пищевой промышленности, стрептококковые эндолизины более применимы в борьбе с заболеваниями в животноводстве и его продуктах, особенно в молоке, пораженного маститом скота.
По данным Schmelcher и Loessner (2016), стрептококковый фаг λSA2 и эндолизин B30 оказывали синергетический литический эффект против S. agalactiae и S. uberis в молоке и в мышиной модели мастита. Также сообщалось, что лизин λSA2 обладал более сильной активностью, чем лизин B30, с сокращением на 3,5 log КОЕ/мл при концентрации 100 мкг/мл. Было также установлено, что эндолизин стрептококкового фага Ply700 обладает быстрым кальций-зависимым лизисом в отношении S. uberis, S. pyogenes и S. dysgalactiae, проявляя при этом незначительную лизирующую активность в отношении S. agalactiae. Исследования также показали, что лизин Ply700 обладает значительной уничтожающей активностью (снижение количества бактерий на 81%) в молоке при концентрации 50 мкг/мл (Celia et al., 2008). С другой стороны, сообщалось, что ClyR проявляет сильную литическую активность против S. dysgalactiae и S. agalactiae в пастеризованном молоке с сокращением на 5 log КОЕ/мл при 25 мкг/мл (Yang et al., 2015).
Другой эндолизин, лизин PlyC, был показан для уничтожения более 20 клинических изолятов S. equi, возбудителя конского странгулеза, высококонтагиозного заболевания лошадей, которое может привести к летальному исходу (Hoopes et al., 2009). Сообщалось, что 1 мкг лизина PlyC может стерилизовать 8-log КОЕ/мл S. equi в течение 30 минут, что в 1000 раз активнее, чем обычное дезинфицирующее средство Virkon-S, используемое для борьбы с болезнями скота.
Аналогичным образом, ожидается, что LySMP, обладающий широким литическим спектром, сможет контролировать инфекцию S. suis у свиней, которая вызывает артрит, эндокардит, менингит, пневмонию и септицемию. Важно отметить, что S. suis является зоонозным агентом, вспышки которого среди людей были зарегистрированы в Китае в 1998, 1999 и 2005 годах; таким образом, борьба с этим заболеванием является актуальной.
Терапия
Фаговая терапия является перспективным альтернативным терапевтическим подходом для лечения различных инфекций животных и человека, вызванных патогенными бактериями. Литическая активность различных эндолизинов также была протестирована и продемонстрирована с помощью мышиных моделей in vivo. Лизин Cpl-1 - это мурамидаза, которая, как сообщается, быстро лизирует несколько других серотипов S. pneumoniae. Также было показано, что он устраняет колонизацию носоглотки S. pneumoniae. Кроме того, димеры Cpl-1 демонстрировали 2-кратное увеличение антибактериальной активности по сравнению с нормальным Cpl-1. Ajuebor et al. (2016) также показали, что лизин Cpl-1 можно аэрозолировать и вводить через дыхательные пути для борьбы с пневмококковыми инфекциями легких.
Лизин PlyC, также называемый стрептококковым лизином C1, является хорошо изученным стрептококковым эндолизином с высокой специфичностью против стрептококков групп A, C и E благодаря двум различным EAD, обладающим синергетической расщепляющей активностью. Лизин PlyC был первым эндолизином, который продемонстрировал эффективность in vivo после носоглоточного инфицирования S. pyogenes мышей. Кроме того, лизин PlyC может уничтожать внутриклеточные S. pyogenes, проникая через эпителиальную клеточную оболочку дыхательных путей .
Другой эндолизин, названный лизином PlyPy, получен из профага, который инфицирует S. pyogenes, и недавно сообщалось о его потенциальном лечении системной бактериемии у мышей. Лизин PlyPy обладает широким спектром активности в отношении стрептококков со скромной активностью в отношении стрептококков групп A, B, C и E, а также S. uberis и S. gordonii. Это также первый идентифицированный эндолизин S. pyogenes с механизмом действия, отличным от лизина PlyC.
Устранение биопленок
Многие патогенные бактерии образуют биопленки, что приводит к резистентности ко многим противомикробным препаратам, что является серьезной проблемой в пищевой промышленности и клинических учреждениях. Shen et al. (2016) показали, что лизин PlyC может быстро разрушать и убивать S. pyogenes внутри матриц биопленок. Лизин Cpl-711, химолизин со слиянием Cpl-7 и Cpl-1, обладает улучшенной антибиопленочной и антимикробной активностью in vitro и in vivo по сравнению с любым из родительских ферментов. Исследования показали, что обработка Cpl-711 сильно снижала прикрепление S. pneumoniae к эпителиальным клеткам человека, а однократная интраназальная доза Cpl-711 значительно снижала колонизацию носоглотки в мышиной модели.
Лизин LySMP, обнаруженный в бактериофаге S. suis серотипа 2, был протестирован на литическую активность против образования биопленки S. suis. Было показано, что лизин LySMP уничтожает более 80% биопленки по сравнению с фагами или антибиотиками. Кроме того, исследования показали, что лечение с использованием 50 мкг/мл лизина ClyR может уменьшить биопленку S. mutans и S. sobrinus в течение 5 минут. Также показано, что непрерывное введение лизина ClyR в модели крыс, инфицированных S. mutans и S. sobrinus, может сократить продолжительность заболевания более чем на 40 дней.
Преимущества и ограничения терапии эндолизинами
Эндолизины высокоспецифичны и лизируют только бактерии-мишени в зависимости от наличия соответствующих связывающих лигандов с различными механизмами расщепления. Такая специфичность обусловила узкий спектр литической активности эндолизинов, который вызывает минимальное нарушение другой микробиоты, что дает им огромное преимущество перед антибиотиками широкого спектра действия. Исследования также показали, что использование более одного эндолизина или комбинирование эндолизинов с другими антимикробными препаратами позволяет добиться синергетического эффекта против бактериальных инфекций. Это может помочь снизить необходимую дозу, используемую для лечения, а также повысить эффективность лечения. Например, исследование Letrado et al. (2018) показало, что комбинация лизина Cpl-711 с амоксициллином или цефотаксимом приводит к синергическому эффекту против клинических изолятов MDR S. pneumoniae.
Развитие лекарственной резистентности у бактерий к эндолизинам также ниже, чем к антибиотикам. Антибиотики действуют путем воздействия на клеточную стенку бактерий, предотвращая их рост и размножение, в то время как эндолизины действуют путем лизиса клеточной стенки бактерий. Кроме того, связывание и расщепление эндолизинов направлено на высококонсервативные участки клеточной стенки, которые вряд ли могут мутировать. Кроме того, эндолизины не проявляют значительных негативных побочных эффектов или токсичности для клеток млекопитающих.
Эндолизины также имеют низкое воздействие на окружающую среду по сравнению с антибиотиками. Поскольку эндолизины состоят в основном из белков, они могут быстро инактивироваться или деградировать под воздействием факторов окружающей среды, в то время как неметаболизированные антибиотики или их остатки, попавшие в окружающую среду, будут оказывать на нее воздействие, которое может косвенно ускорить возникновение MDR бактерий.
Хотя эндолизины имеют много преимуществ, существуют некоторые проблемы, которые ограничивают применение эндолизиновой терапии. Эндолизины показывают хорошую эффективность в лечении грамположительных бактерий, но в основном неэффективны против грамотрицательных бактерий из-за барьера внешней мембраны. К счастью, эта проблема может быть потенциально решена добавлением этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), которая помогает пермеабилизировать клеточную мембрану. ЭДТА - это хелатирующий агент, который разрушает внешнюю мембрану и открывает пептидогликановую клеточную стенку для лизиса. Кроме того, это ограничение можно преодолеть с помощью артилирования грамотрицательных эндолизинов. Наряду с этим, инкапсуляция эндолизинов в средства доставки, такие как хитозановые наночастицы и мукоадгезивные пленки, также может быть изучена для повышения их биодоступности.
На сегодняшний день использование фаговой терапии в большинстве стран все еще сталкивается с проблемами регулирования из-за отсутствия установленных клинических испытаний и данных о безопасности. Тем не менее, фаговая терапия остается действующей в таких странах, как Польша и Грузия, где проводится персонализированное лечение фагами пациентов с инфекциями, резистентными к антибиотикам. Нормативно-правовое регулирование фаговой терапии все еще находится на стадии становления, поскольку на сегодняшний день лицензировано и продается мало продуктов, созданных на основе фагов. Поэтому необходимы дополнительные доказательства успешных испытаний на людях в области фаговой терапии, которые могут помочь нынешним регулирующим органам получить практическое представление о фаговой терапии.
В клинических условиях еще одним важнейшим ограничением эндолизинов является возможность возникновения иммунных реакций, поскольку эндолизины в конечном итоге являются белками. Воспалительные реакции и токсичность эндолизинов были протестированы и оценены на животных моделях, и некоторые эндолизины действительно провоцируют иммунный ответ при систематическом применении. Однако антитела являются слабыми инактиваторами эндолизинов и, как выяснилось, не способны снизить литическую способность эндолизинов в представленных исследованиях. Тем не менее, период полураспада эндолизинов может сократиться из-за иммунного ответа хозяина, как это наблюдалось для эндолизина Cpl-1 у мышей, что может указывать на то, что для уничтожения инфекций может потребоваться многократная дозировка.
Кроме того, было установлено, что эндолизины практически нетоксичны для хозяев. Однако следует отметить, что в исследовании с применением повторных доз эндолизина у собак при ежедневном введении эндолизина SAL200 против Staphylococcus aureus в течение более 1 недели наблюдались некоторые преходящие аномальные клинические признаки, которые включали в себя подчиненное поведение и рвоту. Хотя эти симптомы были легкими и проходили самостоятельно, необходимы дополнительные клинические испытания для дальнейшего подтверждения безопасности эндолизинов для терапии.
Несмотря на многочисленные исследования, подчеркивающие потенциал эндолизинов в качестве альтернативы антибиотикам для борьбы с AMR, их текущая стоимость остается камнем преткновения на данный момент в дополнение к ограничениям, о которых говорилось ранее. Как и для всех терапевтических препаратов на основе белка, стоимость обычно является сдерживающим фактором, когда дело доходит до практического промышленного внедрения из-за относительно высоких затрат на производство, очистку, хранение и цепочку поставок по сравнению с традиционными синтетическими аналогами. Следовательно, экономический анализ и моделирование in silico для крупномасштабного производства и условий процесса, включая оптимизацию среды и условий биореактора, могут помочь снизить затраты. Следует также учитывать затраты на очистку, особенно очистку от эндотоксинов, поскольку E. coli является наиболее часто используемым хозяином для рекомбинантных эндолизинов.
В качестве альтернативы для получения эндолизинов можно использовать фабрики клеток грамположительных микроорганизмов, таких как молочнокислые бактерии. Они признаны безопасными (GRAS), не производят эндотоксинов и могут служить в качестве транспортного средства, что может избавить от необходимости очистки, особенно когда эндолизины выделяются из клеток. Для того чтобы различные отрасли быстрее освоили и приняли новые методы, необходимы постоянные инвестиции, а одобрение фагов и продуктов на основе эндолизина регулирующими органами имеет решающее значение при продвижении их в качестве основных противомикробных препаратов.
Фаговая терапия в настоящее время является популярной областью исследований с высоким потенциалом стать вариантом лечения бактериальных инфекций, включая бактерии с MDR. Их высокая специфичность распознавания и связывания может варьировать от всего рода бактерий до конкретного бактериального штамма, что делает их хорошим кандидатом для замены антибиотикотерапии. Хотя некоторые эндолизины также способны лизировать бактерии разных родов, они встречаются нечасто. Необходимы дальнейшие исследования in vivo и клинические испытания различных эндолизинов, нацеленных на различные виды бактерий, чтобы убедиться, что лизины, производимые фагами, не вызывают никаких форм токсичности, иммунореакций и резистентности к мишени. Кроме того, разработка химолизинов и артилизинов с помощью белковой инженерии и иммунной инженерии имеет потенциал не только для дальнейшего повышения литической активности и расширения круга хозяев-мишеней, но и для преодоления нежелательных иммунологических реакций при систематическом использовании.
