Для секвенирования ДНК это "год больших потрясений", - говорит Майкл Снайдер, системный биолог из Стэнфордского университета.
Секвенирование играет решающую роль в таких областях, как фундаментальная биология, вирусология и эволюция человека, и его значение продолжает расти. Клиницисты стремятся использовать его для раннего выявления рака и других заболеваний, а биологи находят все больше способов использовать геномику для изучения отдельных клеток. Но в течение многих лет секвенирование проводилось в основном на машинах одной компании - Illumina.
Однако на прошлой неделе молодая компания Ultima Genomics заявила на конференции, что благодаря новым изменениям в существующих технологиях она может расшифровывать геномы человека по цене 100 долларов США за штуку, что составляет одну пятую от существующей цены. Несколько других компаний также пообещали более быстрое и дешевое секвенирование на той же конференции Advances in Genome Biology and Technology. В этом году истекает срок действия ключевых патентов, защищающих технологию секвенирования Illumina, что открывает путь для усиления конкуренции, в том числе со стороны китайской компании MGI, которая на прошлой неделе объявила, что начнет продавать свои машины в США этим летом. "Возможно, мы стоим на пороге следующей революции в секвенировании", - говорит Бет Шапиро, эволюционный биолог из Калифорнийского университета.
Большинство компаний, занимающихся секвенированием, включая Illumina, которая контролирует 80% мирового рынка, зависят от "секвенирования путем синтеза" (sequencing by synthesis). ДНК, подлежащая расшифровке, разделяется на отдельные нити, которые обычно нарезаются на короткие фрагменты и закрепляются на поверхности - часто на крошечной бусинке - в контейнере, называемом проточной кюветой. Каждый фрагмент одиночной нити служит шаблоном для синтеза нити с комплементарными основаниями, подаваемыми по одному в каналы бусин. Поскольку каждое добавляемое основание модифицировано и светится, камера может зафиксировать место его присоединения и, следовательно, идентичность соответствующего основания на исходной нити. Эти шаги повторяются до тех пор, пока новая нить ДНК не будет создана полностью.
Ultima упростила этот процесс, распыляя заряженные ДНК бусины миллиардами на круглые кремниевые пластины размером с десертную тарелку. Форсунки над каждой пластиной аккуратно распыляют основания и другие реагенты, которые тонко и равномерно распределяются по пластине при ее вращении, уменьшая количество необходимых дорогостоящих материалов. Вместо того, чтобы двигаться вперед-назад под камерой, диск движется по спирали, подобно тому, как воспроизводится компакт-диск, что ускоряет процесс получения изображений. Это "умная инженерия, которая позволяет избежать множества сложных конструкций", - объясняет молекулярный биолог Марк Акесон. Программа нейронной сети быстро превращает данные визуализации в сиквенс.
Химия секвенирования также отличается. Только несколько оснований несут флуоресцентные метки, что снижает затраты. Кроме того, на основаниях отсутствует обычный стоп-сигнал, что гарантирует отсутствие лишних оснований. Без этих "терминаторов" растущая цепочка иногда может добавлять сразу несколько оснований, ускоряя процесс. "Многие из этих инноваций используются в других отраслях, но здесь они, похоже, очень хорошо сочетаются", - говорит Джей Шендур, генетик и разработчик технологии в Университете Вашингтона.
Генеральный директор Ultima Гилад Альмоги и его коллеги продемонстрировали потенциал технологии в четырех препринтах, опубликованных в конце мая на сайте bioRxiv. В одном из них они и их коллеги из Массачусетского технологического института и Гарварда использовали свою машину для секвенирования более 224 уже секвенированных геномов человека и пришли к выводу, что их результаты соответствуют результатам предыдущих работ. Три других исследования показали, что технология может также оценить репертуар экспрессируемых генов одной клетки, влияние мутаций и эпигенетику - химические модификации ДНК, влияющие на активность генов.
До сих пор стоимость ограничивала такие исследования единичных клеток, что создавало узкое место в исследованиях. Однако Снайдер обнаружил, что недорогой подход Ultima позволил ему провести секвенирование нескольких клеток рака толстой кишки, чтобы задокументировать, как одна из модификаций ДНК, метилирование, изменяется по мере развития рака толстой кишки. В другом препринте Джошуа Левин и его коллеги из Broad Institute проверили способность технологии Ultima определять активные гены в отдельных клетках по транскриптам РНК генов. Команда обнаружила, что машина Ultima идентифицирует эти гены так же хорошо, как и машина Illumina. И, добавляет он, "это меняет дело благодаря более низкой стоимости". Генетик Флоренс Шардон, которая занимается модификацией ДНК с помощью геномного редактора CRISPR, воодушевлена такой перспективой. "Чем дешевле будет стоить [секвенирование], тем более доступными будут такие исследования для большего числа лабораторий и большего числа людей", - говорит она.
Но у Лиора Пахтера, компьютерного биолога из Калифорнийского технологического института, есть сомнения по поводу новой технологии. Он и его коллеги изучали один из самых активных генов в клетках крови - возможный биомаркер рака, известный также тем, что вырабатывает белок, который спортсмены иногда вводят для незаконного повышения своей работоспособности. Технология Ultima иногда пропускала активный ген, говорит Пахтер. Коэффициент ошибок был "очень высок, а производительность очень низкая". В гене есть участок, в котором одно и то же основание повторяется восемь раз, и Ultima признает, что длинные повторы могут снижать точность считывания. В других местах в сиквенсах Ultima Пахтер обнаружил ошибки, когда одно основание повторялось всего три раза. Он отмечает, что человеческий геном содержит не менее 1,4 миллиона этих так называемых гомополимеров. Тем не менее, он говорит: "Для некоторых задач вам не нужны идеальные сиквенсы".
Пахтер и другие также не согласны с заявленной стоимостью в 100 долларов. Эта цифра включает только реагенты, а не трудозатраты, этапы до и после секвенирования и первоначальные расходы на машину, цена которой пока не разглашается. Даже если цифра в 100 долларов реальна, она может оказаться не уникальной: Другие компании также обещают 100 долларов за геном человека.
Одна из них - MGI, дочерняя компания китайского гиганта BGI, занимающегося секвенированием. Технология MGI похожа на технологию Illumina, но она повышает точность, добавляя все четыре основания одновременно при секвенировании ДНК. Для отслеживания того, какие основания были включены, используются антитела, которые ярче и дешевле флуоресцентных красителей. Компания Illumina также обещает снижение стоимости, и на встрече она представила новые химические технологии для повышения точности и гибкости.
Чтобы реализовать эту выгодную цену, Ultima и MGI должны загружать свои секвенаторы сотнями геномов. Но высокопроизводительное секвенирование "не всегда хорошо для клинической практики, даже если это хорошая экономика", - говорит Грег Элгар, биолог-геномщик из Genomics England, - потому что иногда врачу нужен анализ генома всего одного или нескольких человек. Другие компании с новыми проточными ячейками и химическими реактивами могут экономично проводить секвенирование небольшого количества геномов". На конференции на прошлой неделе генеральный директор Element Biosciences Молли Хе сообщила, что компания поставляет настольные секвенаторы, способные одновременно секвенировать три человеческих генома, по цене 560 долларов США каждый. Другая компания, Singular Genomics, также обещает настольную технологию, которая не требует высокой пропускной способности для экономии средств.
Все эти машины, как и машины компаний Illumina, MGI и Ultima, расшифровывают короткие фрагменты ДНК. Но последние 7 лет две компании, Pacific Biosciences и Oxford Nanopore Technologies, работали над секвенированием "длинных чтений" (long reads), длиной в тысячи оснований, что позволяет собрать меньше фрагментов сиквенса в полный геном. По словам Элгара, эти технологии "могут секвенировать родную молекулу ДНК во всей ее красе". Они сталкиваются с проблемами низкой точности и высокой стоимости, но, по его словам, они находятся на пути к тому, чтобы стать практичными приборами.
Гигант секвенирования Illumina пока не стоит сбрасывать со счетов. Ее ученые "вероятно, держат пару карт в заднем кармане", чтобы сохранить свои позиции на рынке, говорит Альберт Вилелла, биоинформатик и консультант по геномике в Кембридже, Англия. Тем не менее, Illumina сталкивается с беспрецедентной конкуренцией, добавляет он. "Пришло время взглянуть на пейзаж [секвенирования ДНК] свежим взглядом".
