Туберкулез (ТБ) остается одной из самых больших глобальных угроз здоровью.
В настоящее время существует острая потребность в биомаркерах ТБ, что сдерживает прогресс в таких насущных направлениях, как разработка вакцин или диагностика. Золотым стандартом диагностики ТБ являются культуральные методы и методы амплификации нуклеиновых кислот. Однако культуральные методы требуют лабораторной инфраструктуры, обученного персонала и предполагают инкубацию культур, что значительно задерживает результат диагностики. Хотя ВОЗ одобрила GeneXpert Mtb/RIF, для улучшения быстрой диагностики лекарственно-чувствительного и резистентного ТБ, он является дорогостоящим и требует технологических инвестиций. Поэтому несмотря на ограниченную чувствительность, составляющую около 50%, культуральные методы остаются стандартным подходом к диагностике ТБ в условиях ограниченных ресурсов.
Быстрая диагностика заболевания имеет решающее значение для снижения передачи, заболеваемости и смертности. В этом контексте ВОЗ считает необходимым направлять и поощрять разработку устройств, используемых для оказания медицинской помощи на местах (POC - point of care testing) для улучшения выявления случаев ТБ. Следовательно, срочно необходимы биомаркеры ТБ, которые могут заложить основу для разработки новых тестов POC. Одним из таких POC является тест на обнаружение в моче липоарабиноманнана (ЛАМ), липогликана клеточной стенки микобактерий. Однако из-за умеренной чувствительности этот метод рекомендуется использовать только у коинфицированных ВИЧ лиц с низким количеством клеток CD4 (Shah et al., 2016). Последние версии этого метода улучшили чувствительность, но этот параметр все еще намного ниже, чем у культуральных и молекулярных методах (обзор в Flores et al., 2021).
Серология ТБ также может быть привлекательным вариантом для диагностики ТБ в условиях ограниченных ресурсов в виде POC-тестов. Исследователи пытались разработать серологические тесты, направленные на дифференциацию ТБ от латентной формы (LTBI) в течение десятилетий. Коммерциализированные тесты отличаются по чувствительности (10-90%) и специфичности (47-100%), и это зависит от включенного антигена, субъекта или места проведения, среди прочих факторов. Помимо внутренней гетерогенности ответов антител (Ab) у больных ТБ (Kunnath-Velayudhan et al., 2010), большинство анализов основано на антигенах, которые вызывают ответы Ab у лиц с развитой формой ТБ. Кроме того, ранние стадии ТБ связаны с низким бактериальным бременем и сопутствующим снижением титров Ab.
Интересно, что ВИЧ-инфицированные больные ТБ, по-видимому, развивают Ab-ответы на меньший репертуар антигенов Mtb по сравнению с ВИЧ-неинфицированными больными ТБ (Sartain et al., 2006). Хотя было показано, что специфичность серологических тестов на ТБ также недостаточна, в основном из-за потенциального вклада реакций, вызванных нетуберкулезными микобактериями или вакцинацией БЦЖ, было показано, что некоторые антигены вызывают специфические для ТБ Ab-ответы (Hendrickson et al., 2000; Achkar et al., 2010).
Большинство форм жизни производят внеклеточные везикулы (EVs). С момента первого обнаружения бактериальных EV более 60 лет назад у Escherichia coli, последующие исследования продемонстрировали их функциональную общность, несмотря на различия в архитектуре клеточной оболочки бактерий. Бактериальные EVs - это "сферические мембранные везикулы с поверхности микробных клеток размером от 20 до 500 нм в диаметре". Мы продемонстрировали, что микобактерия туберкулеза (Mtb), возбудитель туберкулеза, производит EVs in vitro и in vivo как часть сложного механизма манипулирования клеточной физиологией хозяина и уклонения от иммунной системы хозяина (Prados-Rosales et al., 2011).
Микобактериальные EVs (MEVs) обладают иммуномодулирующими свойствами in vitro и при введении мышам (Prados-Rosales et al., 2011; Athman et al., 2015), они обладают перспективными вакцинными свойствами (Prados-Rosales et al., 2014a) и, по-видимому, генетически регулируются (Rath et al., 2013; White et al., 2018). Следовательно, MEVs вызывают значительный интерес в связи с их потенциальной ролью в патогенезе ТБ и их значением для разработки новых профилактических и терапевтических противотуберкулезных стратегий. Более того, мы сообщали, что недостаток железа - состояние хозяина, которое переводит патоген в режим медленной пролиферации, - стимулирует везикуляцию у Mtb (Prados-Rosales et al., 2014b).
В контексте инфекции, EVs, полученные хозяином (HEVs), такие как экзосомы или микрочастицы, могут дистанционно вмешиваться в работу иммунной системы из первичного очага инфекции (Choi et al., 2015). Экзосомы из макрофагов, инфицированных Mtb, активируют провоспалительные реакции, стимулируют созревание дендритных клеток и регулируют презентацию антигенов, что согласуется с бактериальным грузом, связанным с экзосомами (Bhatnagar and Schorey, 2007).
Основная предпосылка экспорта антигенов из инфицированных фагоцитов заключается в том, что связанные с Mtb антигены связываются с мембранами хозяина и перемещаются в экзосомы. Однако сообщения о происхождении EVs в инфицированных Mtb макрофагах опровергли эту точку зрения, показав, что HEVs и MEVs могут представлять собой две независимые популяции везикул (Athman et al., 2015), что указывает на то, что изучение только HEVs в контексте инфекции даст лишь частичное представление о взаимодействии между Mtb и хозяином (Palacios et al., 2021). Поскольку большая часть биологии Mtb происходит внутри иммунных клеток, EVs, полученные в результате этого взаимодействия, могут предоставить ценную информацию о результатах такого взаимодействия.
Поэтому мы предположили, что расшифровка гетерогенности и иммуногенности везикул в контексте Mtb-инфекции человека может способствовать разработке востребованных подходов к борьбе с этим заболеванием. Ранее мы уже оценивали серологические реакции на MEV, выделенные из Mtb и БЦЖ, выращенных в условиях повышенного содержания железа (Fe), у людей, больных туберкулезом, и у контрольных лиц, показав, что набор из трех MEV-ассоциированных белков создает специфический для туберкулеза серологический профиль (Ziegenbalg et al., 2013).
Намереваясь расширить каталог биомаркеров туберкулеза, мы изучили изменения белкового состава в MEV, выделенных из Mtb, подвергшихся такому связанному с хозяином состоянию, как Fe-голодание, по сравнению с Fe-достаточностью. Мы продемонстрировали, что Mtb производят EVs in vitro и in vivo как часть сложного механизма манипулирования клеточной физиологией хозяина и обхода его иммунной системы. В предыдущем серологическом исследовании мы показали, что распознавание нескольких белков, связанных с MEV, может обладать диагностическими свойствами.
В данном исследовании мы попытались расширить возможности MEVs в контексте диагностики ТБ, проанализировав состав MEVs, выделенных из культур Mtb, подвергнутых дефициту железа, и протестировав их иммуногенность против новой когорты образцов сыворотки, полученных от пациентов с ТБ+, пациентов LTBI, и здоровых доноров. Мы обнаружили, что, несмотря на жесткие условия, налагаемые дефицитом железа, Mtb снижает количество ассоциированных с MEV белков по сравнению с условиями достаточного количества железа. Кроме того, серология ТБ выявила три новых антигена MEV со специфическим биомаркерным потенциалом. Эти результаты свидетельствуют о целесообразности разработки теста POC на основе выбранных MEV-ассоциированных белков.
Данное исследование предоставляет ценную информацию для будущих разработок в области диагностики ТБ с акцентом на MEVs:
(i) идентификация надежных маркеров MEV, которые могут быть использованы для прямой диагностики;
(ii) новая биомаркерная сигнатура из трех MEV-белков с потенциалом для косвенной диагностики заболевания.
Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить целесообразность использования MEVs в качестве платформы для улучшения диагностики ТБ.
