Интересные микробиологические случаи: важность окрашивания проб из флаконов с культурами крови, в которых не обнаружены микроорганизмыИнтересные микробиологические случаи: важность окрашивания проб из флаконов с культурами крови, в которых не обнаружены микроорганизмы
83-летняя женщина с диабетом 2 типа в анамнезе поступила в отделение неотложной помощи с двухмесячной дизурией и диареей.
При поступлении были проведены тесты в отношении Clostridiodes difficile, культура мочи и 2 набора образцов культуры крови. Тест на C. difficile был положительным на антиген глутаматдегидрогеназы и токсинов A/B. Культура мочи была положительной с 50 000 - 99 000 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл Klebsiella pneumoniae. Пациентке назначили цефтриаксон, метронидазол и ванкомицин и выписали через три дня после поступления. В день выписки посев крови был документирован как "отсутствие роста в течение 3 дней". Пациентка посетила своего лечащего врача на следующий день после выписки. Через два дня в кабинет первичного врача поступило уведомление об уточненном заключении. Культура крови пациентки, взятая в день поступления, была исправлена с отсутствия роста на положительную с ростом Fusobacterium nucleatum. С пациенткой связались, чтобы проверить ее состояние, и проверили соблюдение режима приема лекарств. Пациентка продолжала демонстрировать улучшение симптомов при наблюдении в кабинете врача через 10 дней после выписки.
Что же произошло? Культура крови была взята в клинике неотложной помощи. Согласно политике микробиологической лаборатории этой клиники, при получении первого положительного результата на культуру крови, в котором не обнаружено ни одного видимого микроорганизма (no organisms seen - NOS), необходимо провести инокуляцию на соответствующие среды и приготовить три мазка. Один из мазков окрашивается по Граму, и если микроорганизмы не видны, окрашенный и неокрашенный мазки вместе с инокулированной средой отправляются в централизованную микробиологическую лабораторию. Затем флакон должен быть вновь загружен в прибор для культивирования крови.
При повторном положительном сигнале того же флакона с NOS необходимо инокулировать соответствующую среду и приготовить 3 мазка. Один из мазков окрашивается по Граму, и если организмы по-прежнему не видны, окрашенный и неокрашенный мазки отправляются в централизованную лабораторию вместе с положительным флаконом и инокулированной средой. Централизованная лаборатория должна использовать неокрашенный мазок для окрашивания акридиновым оранжевым (АО).
В случае этой пациентки флакон с анаэробной культурой крови из одного набора был признан положительным на 4-й день инкубации. Окраска по Граму была признана NOS, и инокулированные среды и мазки были отправлены в централизованную лабораторию. Флакон был перезагружен в прибор, и в тот же день он второй раз был признан положительным. Из флакона был сделан новый мазок, который был окрашен АО, и он вновь был признан NOS.
В нашей лаборатории, если результат окрашивания по Граму не дополняет данные по культуре крови, она автоматически проверяется как отрицательная культура крови каждые 24 часа с окончательным отрицательным результатом через 5 дней. Оба набора культур крови этой пациентки показали отсутствие роста на 5 день. При считывании культуры через 48 часов (6 дней после взятия) посевы на кровяном и шоколадном агаре не показали роста, но анаэробный агар CDC показал рост. Изолят был идентифицирован методом масс-спектрометрии MALDI и на 99,9% соответствовал Fusobacterium nucleatum.
В соответствии с протоколом был проведен анализ мазков этой противоречивой культуры. Неокрашенный мазок, присланный лабораторией неотложной помощи, не был окрашен AO и не был просмотрен в соответствии с протоколом. Вместо этого, как упоминалось выше, было проведено окрашивание по Граму нового неокрашенного мазка, и он был признан NOS. При просмотре этого мазка, окрашенного АО были обнаружены длинные тонкие флуоресцирующие палочки с сужающимися концами (илл. 1).
![](/uploads/editor_image/url/580/image.png)
Иллюстрация 1. Окраска акридиновым оранжевым.
Мазок, который был отправлен после второго положительного сигнала, но не был окрашен и прочитан, также был окрашен AO, и в нем были видны длинные тонкие флуоресцирующие палочки с коническими концами (илл. 2).
![](/uploads/editor_image/url/581/image.png)
Иллюстрация 2. Окраска акридиновым оранжевым.
На этом этапе исследования также был просмотрен мазок с окраской по Граму из первого положительного флакона, присланное из лаборатории больницы неотложной помощи. Зная, что флакон был положительным на F. nucleatum, бактериолог сообщила, что в итоге увидела редкие длинные тонкие грамотрицательные палочки с заостренными концами, которые совпадали с тем, что было видно при окраске АО (илл. 3).
![](/uploads/editor_image/url/582/image.png)
Иллюстрация 3. Окраска по Граму.
При окрашивании еще на 10 минут был добавлен сафранин, что позволило выявить микроорганизм более четко (илл. 4).
![](/uploads/editor_image/url/583/image.png)
Иллюстрация 4. Окраска по Граму с сафранином.
Обсуждение
Fusobacterium - это облигатные анаэробные грамотрицательные палочки, которые окрашиваются по Граму как светлоокрашенные тонкие палочки с заостренными концами. Fusobacterium встречаются в орофарингеальной флоре и часто встречаются в биопленках полости рта. Это основной возбудитель периимплантита, инфекций корневых каналов, дентоальвеолярных абсцессов и распространяющихся одонтогенных инфекций. Он также может быть возбудителем абсцессов в различных частях тела и попадать в кровоток.
Из-за особенностей окраски видов Fusobacterium они часто сливаются с фоном окраски по Граму при положительных посевах крови. В результате пропуск окрашивания по Граму и задержка роста культуры в сочетании с поздним обнаружением Fusobacterium на приборах для культивирования крови для этих привередливых организмов может привести к ложноотрицательному заключению, которое обнаруживается только после того, как организм вырастает из первоначального флакона с NOS.
Сафранин - это вторичное или контр-окрашивание, используемое при окраске по Граму, которое окрашивает бесцветные грамотрицательные бактерии в розовый или красный цвет. По имеющимся данным, Brucella melitensis, Legionella и Campylobacter усиливают окраску за счет 2-х минутной окраски сафранином, а при подозрении на анаэробы и отсутствии таковых рекомендуется оставить окраску на 3-5 минут или использовать основной фуксин, чтобы усилить морфологию этих микроорганизмов. По этой причине некоторые лаборатории регулярно используют основной фуксин в качестве контр-окрашивания.
Акридиновый оранжевый (АО) - это флуорохроматический краситель, который связывается с нуклеиновыми кислотами микроорганизмов и клеток человека. РНК и одноцепочечная ДНК окрашиваются в оранжевый цвет, а двуцепочечная ДНК, содержащаяся в клетках человека, за исключением эритроцитов, окрашивается в желтый или желто-зеленый цвет при визуализации под ультрафиолетовым светом. Таким образом, бактерии и грибы окрашиваются в ярко-оранжевый цвет, а эпителиальные клетки, лейкоциты и фоновые фрагменты - в бледно-зеленый или желтый. Среди распространенных применений AO - рутинный скрининг обычно стерильных жидкостей организма и исключение грамположительных микроорганизмов на фоне преципитата, окрашенного кристаллическим фиолетовым. Важно отметить, что, несмотря на невозможность дифференцировать реальный микроорганизм, он помогает обнаружить Mycoplasma и Ureaplasma.
Заключение
Слепое субкультивирование NOS, окрашенных по Граму, из положительных культур крови, более длительное окрашивание сафранином и окрашивание AO - все это полезно добавить в арсенал микробиологической лаборатории. Они особенно полезны при включении в протокол исследования стерильных образцов из участков тела, где можно заподозрить наличие организмов, которые окрашиваются слабо и сливаются с фоном.