Учёные используют бесклеточные системы транскрипции и трансляции для синтеза белков, создания биологических сенсоров и разработки синтетических клеток.
Майкл Джуэтт порой сталкивается с трудностями, связанными с особенностями биологии. Как биоинженер, использующий синтетическую биологию для изучения способов улучшения здоровья человека и планеты, Джуэтт нуждается в микроорганизмах, способных производить определённые соединения или следовать заданным им генетическим инструкциям. Однако клетки, эволюционировавшие с целью обеспечения собственного выживания и размножения, преследуют иные цели. Микробы могут, например, деактивировать чужеродные сегменты ДНК — или трансгены — вставленные в их геном Джуэттом. Или они могут направлять клеточные ресурсы на удовлетворение собственных потребностей, а не на достижение исследовательских целей Джуэтта.
Поэтому он изменил подход. «Вместо того чтобы вступать в эту борьбу, которая существует между тем, что хотят делать клетки, и тем, что хотим делать мы, инженеры, мы просто разорвали эту связь», — рассказывает Джуэтт. «Мы срываем с клеток их клеточные стенки, извлекаем внутреннее содержимое, а затем используем его в качестве молекулярной фабрики для осуществления биологических процессов». Эта идея не нова: системы, основанные на бесклеточной экспрессии белков, помогли исследователям расшифровать генетический код ещё в 1960-х годах. Но технология по-прежнему развивается. «Я бы охарактеризовал это как очень модную тенденцию», — говорит биофизик Винсент Нуаро, чья исследовательская группа разработала собственную систему.
Хотя их состав варьируется, системы бесклеточной экспрессии белков, как правило, содержат весь необходимый механизм для транскрипции ДНК в матричную РНК и её трансляции в белки. Эти системы могут быть основаны на лизатах бактериальных или эукариотических клеток либо собраны из очищенных компонентов. Последняя технология называется «Синтез белков с использованием рекомбинантных элементов» (Protein Synthesis Using Recombinant Elements - PURE). С помощью этих методов разработчики белков могут отбирать сотни или тысячи вариантов без необходимости модификации и культивирования клеток. Это сокращает цикл «проектирование–создание–тестирование–анализ» с дней или недель до часов, говорит специалист по синтетической биологии Уилсон Вонг.
Учёные могут производить вещества, которые были бы токсичны для живых клеток или подвергались бы расщеплению или изменению под действием клеточных ферментов. Некоторые исследователи разрабатывают лиофилизированные составы для создания систем синтеза по требованию, предназначенных для производства биологических лекарственных средств, таких как вакцины, или для использования в качестве портативных наборов для проверки качества воды, диагностики на месте оказания медицинской помощи и других целей. Между тем специалисты по синтетической биологии изучают системы PURE в качестве отправной точки для создания искусственных клеток. «Происходит много интересного, — говорит Нуаро, — демонстрируется множество новых применений, появляются новые бесклеточные системы экспрессии генов, демонстрирующие новые свойства».
Бесклеточные системы обещают скорость, настраиваемость и удобство — но за определённую цену. Реагенты, необходимые для работы бесклеточной системы объёмом в один литр, могут стоить более 4 000 долларов США, а в большинстве исследований сообщается о получении менее двух граммов белка, что делает эти системы на порядок дороже, чем системы синтеза белков на основе клеток. Чтобы сделать высокопроизводительный скрининг доступным, некоторые исследователи работают в масштабах менее одного микролитра. И в то время как биоинженеры могут культивировать целый чан бактерий или дрожжей, непрерывно синтезирующих нужные продукты, удаляя полученные продукты и добавляя свежую среду, бесклеточные системы быстро исчерпывают свои запасы энергии. «Что бы вы ни пытались сделать, это должно завершиться за несколько часов», — говорит Вонг.
Для бесклеточных сенсоров это не представляет проблемы: им достаточно обнаружить интересующую молекулу и сгенерировать измеримый сигнал в течение нескольких десятков минут. «Природа уже создала все эти сенсоры», — утверждает коллега Джуэтта Юлиус Лакс. Дело в том, что клеткам часто приходится распознавать металлы, антибиотики и другие мелкие молекулы и реагировать на них. Хотя учёные могут использовать клетки в качестве живых биосенсоров, это сопряжено со значительными трудностями. Клетки необходимо поддерживать в живом состоянии, а интересующие молекулы должны проникать через клеточную стенку и мембраны. Кроме того, исследователи рискуют выпустить генетически модифицированные организмы в окружающую среду.
Переход к бесклеточному подходу означал, что Лакс может построить минимальную биологическую систему, избегая сложностей, связанных с использованием живых организмов. В 2020 году его группа описала специально разработанную систему под названием ROSALIND, в которой в качестве датчиков используются ДНК-связывающие факторы транскрипции. Транскрипционные факторы блокируют синтез РНК до тех пор, пока не столкнутся с конкретным загрязнителем или интересующей молекулой. Как только это происходит, белок отрывается от ДНК и ген транскрибируется, генерируя сигнал. В качестве доказательства принципа работоспособности исследователи успешно протестировали лиофилизированные системы ROSALIND, обнаружив медь и цинк в пробах, взятых из муниципальных систем водоснабжения, загрязнённых в результате лесного пожара 2018 года в Калифорнии.
Однако бесклеточный синтез особенно хорошо себя зарекомендовал при применении в быстрой итеративной инженерии белков, которая может включать в себя проектирование с использованием методов машинного обучения. Лакс, Джуэтт и их коллеги применили этот подход для доработки ещё одного биосенсора на основе транскрипционного фактора — на этот раз для обнаружения свинца. Свинец представляет собой сложный загрязнитель, поскольку многие сенсоры, распознающие его, также связываются с цинком, который, как правило, не считается вредным. Чтобы создать датчик, избирательно реагирующий на свинец, команда внесла в модель машинного обучения данные о широком спектре мутантных белков, способных обнаруживать свинец, и использовала полученные результаты для разработки следующего набора мутантов, которые затем тестировались в бесклеточной системе. Всего за несколько циклов удалось получить появился датчик, способный обнаруживать свинец при концентрации всего 5,7 частей на миллиард. «Я считаю, что бесклеточные системы будут играть всё более важную роль в науке благодаря своим преимуществам, позволяющим ускорить экспрессию от десятков до сотен тысяч белков», — говорит Джуэтт.
Некоторые датчики, разработанные Лаксом, доступны в некоммерческом репозитории реагентов Addgene и включают файлы с подробными инструкциями по проведению реакций. «Мы действительно стараемся сделать их максимально удобными для пользователей, — говорит он. — Если у них получается организовать реакцию in vitro, то они смогут настроить и запустить эту систему». Для тестирования сенсоров команда Джуэтта вырастила лабораторных бактерий Escherichia coli, раздробила клетки и использовала их содержимое в качестве «смеси» для экспрессии белков. По сравнению с системами PURE такие «лизаты» часто обеспечивают более высокую производительность при меньших затратах, что делает их идеальными для производства белков, отмечает Эмили Чен, научный сотрудник по производству в компании New England Biolabs (США). Например, система синтеза белков NEBExpress этой биотехнологической компании основана на лизатах E. coli.
Покупка клеточных лизатов может быть выгодным решением, отмечает Чен, особенно для стартапов и лабораторий, не располагающих всем необходимым оборудованием для производства белков на клеточной основе. Среди других коммерческих систем на основе E. coli можно назвать myTXTL, продаваемую компанией Daicel Arbor Biosciences; наборы CFPS от Ginkgo Bioworks; а также CFXpress от GenScript (все эти компании из США). Некоторые поставщики также предлагают составы, способные улучшить производство трудноэкспрессируемых соединений. Например, набор CFPS Premium от Ginkgo включает усилитель растворимости для белков, которые являются особенно крупными, нерастворимыми или нуждаются в дополнительной помощи при фолдинге, — объясняет Синтия Коллинз, генеральный менеджер подразделения реагентов компании Ginkgo.
Исследователи, которым предстоит использовать большие объёмы лизатов, могут сэкономить средства и адаптировать реагенты под свои нужды, изготавливая их самостоятельно, однако Нуаро рекомендует ученым, только начинающим работать с системами белковой экспрессии в бесклеточных условиях, сначала освоиться с помощью стандартизированных коммерческих продуктов. Лизаты, будь то самодельные или коммерческие, необходимо дополнять такими компонентами, как глюкоза и нуклеотиды. Эти реагенты помогают воссоздать клеточную среду, обеспечивают энергию и сырьё для трансляции белков, а также повышают производительность, говорит Джуэтт. Его лаборатория нашла способы сократить затраты, определив, какие из них являются необходимыми для процесса. Исследователи протестировали 1 231 рецептуру с использованием лизатов, полученных в лабораторных условиях, и оптимизировали состав до всего 12 реагентов. Это позволило сократить затраты на 95%, до менее чем 100 долларов за грамм произведённого белка.
Также доступны лизаты, полученные из других типов клеток. Они обладают такими преимуществами, как возможность синтезировать белки с посттрансляционными модификациями, включая сахара или молекулы убиквитина, чего не позволяют сделать готовые бактериальные системы. Раньше исследователи часто использовали лизаты, полученные из незрелых эритроцитов, или ретикулоцитов, взятых у кроликов с анемией. Однако эта модель вызывает как этические проблемы, связанные с использованием животных, так и научные сомнения. Процесс трансляции в них уникален, предупреждает независимый исследователь Эван Карусис. Необычно то, что ретикулоциты не нуждаются в «шапке» мРНК для защиты мРНК и стимулирования трансляции, они инициируют трансляцию в неканонических сайтах и обладают ферментами, способными разлагать РНК-транскрипты. Карусису пришлось прекратить трехлетний проект, когда он обнаружил, что лизаты ретикулоцитов кроликов используют нестандартный подход к процессу распада РНК, который он исследовал.
Карусис предлагает исследователям, изучающим трансляцию, а не просто стремящимся синтезировать белки, найти систему лизатов, которая максимально соответствует изучаемой ими биологии. С этой целью исследовательская группа, которую он ранее возглавлял в Бернском университете, разработала методы получения лизатов из различных линий человеческих клеток. Исследователи создали бесклеточные системы трансляции с использованием клеток, полученных из рака шейки матки (HeLa), эмбриональных почек (HEK-293), а также из опухолей, известных как нейробластома (SH-SY5Y) и остеосаркома (U2OS). По его данным, из всех этих систем наиболее эффективную трансляцию обеспечивали лизаты из клеток HeLa.
Растения также предлагают удобные бесклеточные системы — особенно полезны лизаты из светопоглощающих органелл клеток, называемых хлоропластами, — говорит специалист по синтетической биологии Хенрика Нидерхольтмайер. Это связано с тем, что биоинженеры, работающие с растениями, иногда предпочитают экспрессировать трансгены в хлоропластах, а не в ядре. Модификации ядерной ДНК могут привести к подавлению экспрессии трансгенов или сделать их экспрессию непредсказуемой. Проблемой также является биологическая изоляция, поскольку ядерная ДНК переносится с пыльцой. Использование модифицированных хлоропластов позволяет избежать этих проблем. Однако, по словам Нидерхольтмайер, инженерия хлоропластов — дело нелегкое. К тому же это медленный процесс: чтобы проверить гены и белки, учёным приходится ждать, пока растения вырастут. Поэтому целесообразно сначала тестировать трансгены или регуляторные последовательности в лизатах хлоропластов. Она, Джуэтт и их коллеги сравнили экстракты хлоропластов пшеницы, шпината и тополя и обнаружили, что с помощью системы шпината можно предсказать экспрессию в отдаленно родственной пшенице.
Чтобы получить достаточное количество экстракта только из хлоропластов, требуется много листьев. Нидерхольтмейер рассказывает, что её аспирант еженедельно скупал весь запас шпината в местном супермаркете и они уменьшили объём реакций до 400 нанолитров. Однако исследование показало, что лизаты хлоропластов шпината могут служить надёжным аналогом для других видов растений. Самодельные лизаты могут значительно различаться от лаборатории к лаборатории, от учёного к учёному и от партии к партии. Джуэтт рекомендует учёным, которые только начинают заниматься приготовлением лизатов, вначале в точности следовать существующим протоколам. «Не ведите себя как шеф-повар и не пытайтесь с самого начала создавать что-то своё», — советует он.
Одной из самых значительных переменных является процесс лизиса: в некоторых лабораториях клетки разрушают, пропуская их через гомогенизатор; в других — механически разбивают с помощью бус. Группа Карусиса адаптировала метод, называемый двойным центрифугированием — используемый в химической промышленности — для сдвига клеток путем их вращения сразу вокруг двух осей. Группа Джуэтта пришла к выводу, что ультразвуковой разрушитель, использующий высокочастотные звуковые волны для разрыва клеточных мембран, будет доступен по цене для большинства лабораторий. Поэтому его команда разработала воспроизводимый протокол с использованием такого устройства. По его словам, партии, полученные каждым из примерно 20 исследователей в его лаборатории, различаются на 5–10% по количеству зелёного флуоресцентного белка, который они дают.
Тем не менее, натуральные лизаты не способны решить все задачи. «Клеточный экстракт — это очень сложная смесь», — говорит специалист по синтетической биологии Ян Чжан. Чжан интересуется сенсорами, но, по её словам, некоторые лизаты естественным образом содержат молекулы, которые она хотела бы обнаружить, что может сбивать с толку при проведении экспериментов. И именно в этом заключается привлекательность систем PURE: они чистые, контролируемые и настраиваемые. «Вы точно знаете, что в них содержится», — говорит Вонг. «В биологии это большая редкость — точно знать, что в них содержится».
Системы PURE создаются с использованием рекомбинантных технологий и трансгенных бактерий для синтеза и очистки 36 нерибосомальных белков E. coli, необходимых для осуществления транскрипции и трансляции in vitro. Единственным элементом, производство которого учёные пока не освоили, является многокомпонентная рибосома, которую необходимо очистить в целостном виде. К коммерческим технологиям PURE относятся PURExpress от компании NEB и PUREfrex от компании GeneFrontier (Япония). Если вы хотите создать собственную систему PURE, процесс этот сложный, но становится всё проще. Первоначальный метод, разработанный 25 лет назад, требовал от учёных выращивания 36 культур для выделения всех необходимых компонентов. «Это вполне выполнимо, — говорит биоинженер Себастьян Меркл. — Но это очень трудоёмко». Его команда решила объединить штаммы бактерий в одну культуру, а затем выделить все белки. К удивлению исследователей, их система OnePot PURE сработала. На получение 15 миллилитров компонентов PURE ушло 20 часов в течение четырёх дней. В сочетании с очищенными рибосомами лаборатории система OnePot PURE дала в 14 раз больше белка, чем коммерческий набор при тех же затратах.
Однако, как и в случае с лизатами, системы PURE через несколько часов исчерпывают запасы энергии и материалов. Поэтому следующим шагом для Меркла и его коллег станет создание самоподдерживающейся системы, способной самостоятельно производить свои компоненты. Именно в этом аспекте бесклеточные экстракты находят применение в синтетической биологии и некоторые учёные используют PURE в качестве отправной точки для создания синтетических клеток. «Именно это не даёт нам спать по ночам: как нам создать систему синтетических клеток?» — говорит Меркл.
Но бессонные ночи Меркла приносят свои плоды. В 2020 году его группа сообщила о синтезе нескольких необходимых белковых компонентов с использованием самой системы PURE. В 2025 году как его группе, так и другой команде удалось заставить системы PURE самостоятельно синтезировать все свои транспортные РНК — компоненты, которые обычно приходится добавлять отдельно. А в мае команда Меркла использовала PUREfrex для синтеза всех компонентов PURE, за исключением рибосом. Затем группа очистила белки и использовала их для сборки системы PURE второго поколения. Однако выход оказался неутешительным: система произвела материала, достаточного лишь для одной десятой от объема исходной реакции. «Эта система, можно сказать, сразу же сходит на нет», — говорит Меркл, который уже добился прогресса в создании более устойчивой системы.
Пользователи бесклеточных технологий отмечают, что клеткам по-прежнему есть место в производстве белков, особенно в крупномасштабном биопроизводстве. Тем временем группа Джуэтта пытается синтезировать рибосому, что позволило бы завершить создание искусственной системы PURE и сделать самоподдерживающиеся реакции реальной перспективой. «Это большой скачок по сравнению с тем, где мы находимся сейчас», — признает Джуэтт. Но если это сработает, некоторым исследователям, возможно, вообще не понадобятся клетки.
