Различные штаммы SARS-CoV-2 еще не оказали серьезного влияния на течение пандемии, но могут оказать его в будущем.
Когда в этом году КОВИД-19 распространился по всему миру, Дэвид Монтефиори задался вопросом, как смертельный вирус, вызвавший пандемию, может меняться по мере того, как он переходит от человека к человеку. Монтефиори - вирусолог, посвятивший большую часть своей карьеры изучению того, как случайные мутации при ВИЧ помогают вирусу ускользнуть от иммунной системы. То же самое, по его мнению, может произойти и с SARS-CoV-2.
В марте Монтефиори, который руководит исследовательской лабораторией по разработке вакцины против СПИДа в Университете Дьюка в Дареме (Северная Каролина), связался с Бетт Корбер, экспертом по эволюции ВИЧ. Корбер, специалист по вычислительной биологии из Национальной лаборатории Лос-Аламоса (LANL) в Санте-Фе, штат Нью-Мексико, уже начала исследовать тысячи генетических последовательностей коронавируса на предмет мутаций, которые могли бы изменить свойства вируса по мере того, как он распространяется по всему миру.
По сравнению с ВИЧ, SARS-CoV-2 изменяется гораздо медленнее по мере его распространения. Но одну мутацию Корбер нашла. Она находилась в гене, кодирующем белок шипа, помогающий частицам вируса проникать в клетки. Корбер видела мутацию, появляющуюся снова и снова в образцах от людей с КОВИД-19. В 614-ой аминокислотной позиции белка шипа аминокислота аспартат (D, в биохимическом сокращении) регулярно заменялась глицином (G) из-за дефекта копирования, который изменил один нуклеотид в 29.903-буквенном РНК-коде вируса. Вирусологи назвали это мутацией D614G.
В апреле Корбер, Монтефиори и другие предупреждали в препринте, размещенном на сервере BioRxiv, что "количество D614G растет с угрожающей скоростью ". Он быстро стал доминирующей линией SARS-CoV-2 в Европе, а затем занял позиции в Соединенных Штатах, Канаде и Австралии. D614G представлял собой "более трансмиссивную форму SARS-CoV-2", которая возникла как продукт естественного отбора, говорилось в статье.
Эти утверждения разочаровали многих ученых. Не было ясно, почему вирусная линия D614G была более трансмиссивной. Но тревога быстро распространилась по СМИ. Хотя многие новости содержали предостережения ученых, в некоторых заголовках говорилось о том, что вирус мутирует, чтобы стать более опасным. Оглядываясь назад, Монтефиори говорит, что он и его коллеги сожалеют, что эта тенденция была описана как "опасная". Это слово было вычеркнуто из версии статьи, опубликованной в Cell в июле.
Работа вызвала бурный интерес к D614G. Даже те, кто скептически относился к тому, что мутация изменила свойства вируса, соглашались с тем, что он интересен из-за его стремительного роста и вездесущности. В течение нескольких месяцев эта линия была обнаружена почти во всех секвенированных образцах SARS-CoV-2.
К концу июня мутация D614G обнаруживалась почти во всех исследуемых в мире образцах SARS-CoV-2.
Но ситуация менее ясна, чем предполагали Монтефиори и Корбер. Некоторые эксперименты показывают, что вирусы, несущие этот вариант, легче заражают клетки. Другая работа выявила возможные хорошие новости: этот вариант может означать, что вакцины легче могут бороться с SARS-CoV-2. Тем не менее, многие ученые утверждают, что нет веских доказательств того, что D614G оказывает существенное влияние на распространение вируса, или что его рост объясняется процессом естественного отбора.
У исследователей до сих пор больше вопросов, чем ответов о коронавирусных мутациях, но детальное изучение мутаций может быть важным для борьбы с пандемией. Это также могло бы помочь предотвратить мутации, вызывающие наибольшую озабоченность: мутации, которые могли бы помочь вирусу уклониться от иммунной системы, вакцин или терапии антителами.
Медленное изменение
Вскоре после того, как SARS-CoV-2 был обнаружен в Китае, исследователи начали анализировать вирусные образцы и размещать генетические коды в Интернете. Мутации - в большинстве случаев однобуквенные изменения между вирусами от разных людей - позволили исследователям отслеживать распространение, связывая близкородственные вирусы, и попытаться установить, когда SARS-CoV-2 начал инфицировать человека.
Вирусы, кодирующие свой геном в РНК, такие как SARS-CoV-2, ВИЧ и грипп, склонны быстро набирать мутации поскольку ферменты, копирующие РНК, предрасположены к ошибкам. Например, после того, как вирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) начал циркулировать в организме человека, у него развилась своего рода мутация, называемая делецией, которая могла замедлить его распространение.
Однако данные секвенирования позволяют предположить, что коронавирусы изменяются медленнее, чем большинство других РНК-вирусов, возможно, из-за "корректирующего" фермента, который исправляет потенциально фатальные ошибки копирования. Типичный штамм SARS-CoV-2 накапливает в своем геноме всего две однобуквенные мутации в месяц - скорость изменения составляет примерно половину от скорости изменения гриппа и четверть от скорости изменения ВИЧ, говорит Эмма Ходкрофт, молекулярный эпидемиолог из Университета Базеля, Швейцария.
Другие данные по геному подчеркивают эту стабильность - более 90 000 изолятов были секвенированы и обнародованы (см. www.gisaid.org). Два изолята SARS-CoV-2, собранные из любой точки мира, отличаются в среднем всего на 10 букв РНК из 29 903, говорит Люси Ван Дорп, специалист по вычислительной генетике из Университетского колледжа Лондона, которая отслеживает различия по признакам дающим эволюционное преимущество.
Несмотря на вялую скорость мутаций вируса, исследователи каталогизировали более 12 000 мутаций в геномах SARS-CoV-2. Но ученые могут обнаружить мутации быстрее, чем они могут понять их смысл. Многие мутации не влияют на способность вируса распространяться или вызывать заболевания, поскольку они не изменяют форму белка, в то время как мутации, которые изменяют белки, скорее наносят вред вирусу, чем улучшают его.
Многие исследователи подозревают, что если мутация действительно помогла вирусу быстрее распространяться, то, вероятно, это произошло раньше, когда вирус впервые попал в человека или приобрел способность эффективно перемещаться от одного человека к другому. В то время, когда почти каждый человек на планете восприимчив к вирусу, это скорее всего, не будет оказывать существенного эволюционного давления на него, побуждая его быстрее распространяться, поэтому даже потенциально полезные мутации могут и не проявиться.
Быстрое распространение?
Когда Корбер увидела быстрое распространение D614G она подумала, что возможно нашла пример осмысленного естественного отбора. Мутация привлекла ее внимание из-за положения в белке шипа, который является основной мишенью для "нейтрализации" антител, связывающихся с вирусом и делающих его неинфекционным. И количество вирусов с мутацией также участилось более чем в одной части света.
Впервые D614G был замечен в вирусах, собранных в Китае и Германии в конце января; большинство ученых подозревают, что мутация возникла в Китае. Сейчас она почти всегда сопровождается еще тремя мутациями в других частях генома SARS-CoV-2 - возможные доказательства того, что большинство вирусов D614G имеют общего предка.
Быстрый рост D614G в Европе привлек внимание Корбер. До марта - когда большая часть континента была на карантине - присутствовали как не мутировавшие вирусы 'D', так и мутировавшие вирусы 'G', причем вирусы 'D' преобладали в большинстве западноевропейских стран, в которых генетики отбирали образцы в то время. В марте частота появления вирусов G возросла по всему континенту и к апрелю они стали доминирующими, сообщили Корбер, Монтефиори и их группа.
Но естественный отбор в пользу вирусов G - не единственное и даже не самое вероятное объяснение этой закономерности. Европейское доминирование вариантов G может быть просто случайным. Небольшое количество людей похоже несут ответственность за большую часть распространения вируса и ранний, случайный уклон в пользу вирусов G мог бы объяснить его явное превалирование в настоящее время. Такие "эффекты основателя" распространены среди вирусов, особенно когда они распространяются бесконтрольно, как это делал SARS-CoV-2 на большей части Европы до середины - конца марта.
Корбер и ее коллеги попытались исключить эффект "основателя", показав в апрельском препринте, что D614G быстро стал доминировать в Канаде, Австралии и некоторых частях Соединенных Штатов (исключение составила Исландия, где вирусы G, присутствовавшие на ранней стадии вспышки, были поглощены вирусами D). Анализируя данные о госпитализациях из Шеффилда, Великобритания, команда не обнаружила никаких доказательств того, что вирусы, носившие мутацию, делали людей еще более больными. Но у тех, кто был инфицирован вирусами G, уровень вирусной РНК в носу и во рту был несколько выше, чем у тех, кто был инфицирован D-вирусами.
Монтефиори говорит, что взгляды его и Корбер на D614G были сформированы их работой по ВИЧ, в ходе которой было установлено, что даже кажущиеся незначительными мутации могут оказать значительное влияние на то, как иммунная система распознает этот вирус.
Гонка лабораторных исследований
Для дальнейшего изучения того, сделал ли D614G более трансмиссивным вирус, Монтефиори оценил его воздействие в лабораторных условиях. Он не смог изучить естественный вирус SARS-CoV-2 в своей лаборатории из-за недостатка необходимой биологической защиты. Поэтому он изучал генетически модифицированную форму ВИЧ, в которой для заражения клеток использовался белок спайка SARS-CoV-2. Такие "псевдовирусные" частицы являются рабочей лошадкой вирусологических лабораторий: они позволяют безопасно изучать смертельные патогенные микроорганизмы, такие как вирус Эбола, и облегчают проверку эффектов мутаций.
Исследователь Томас Ньялил из Медицинской школы Массачусетского университета в Вустере изучает влияние белкового варианта спайка D614G на контагиозность. В эксперименте используется псевдовирус не требующий высокой степени биобезопасности.
Первую команду, сообщившую о псевдовирусных экспериментах с D614G, в июне возглавили Хьерюн Чо и Майкл Фарзан, вирусологи из Научно-исследовательского института Скриппса в Ла Джолле, Калифорния. Несколько других групп разместили аналогичные исследования во BioRxiv (эксперименты Монтефиори и другого сотрудника появились в статье в Cell). Ученые использовали различные псевдовирусные системы и тестировали их на различных типах клеток, но эксперименты указывали на один и тот же вывод: вирусы, несущие мутацию G инфицировали клетки гораздо сильнее, чем D-вирусы - в некоторых случаях в десятки раз эффективнее.
В лабораторных испытаниях "все мы согласны с тем, что замена D на G делает псевдовирусы более контагиозными", - говорит Джереми Лубан, вирусолог из Медицинской школы Массачусетского университета в Вустере. Но эти исследования сопровождаются многими предостережениями и их значение для человеческих инфекций неясно. "Что раздражает, так это то, что люди получают свои результаты в очень контролируемых условиях и говорят, что это что-то значит для пандемии". Псевдовирусы в большинстве случаев несут только белок шипа коронавируса, поэтому эксперименты измеряют только способность этих частиц проникать в клетки, а не аспекты их воздействия на клетки, не говоря уже об организме". Им также не хватает трех других мутаций, которые несут почти все вирусы D614G. "Суть в том, что это не вирус", - говорит Лубан.
Некоторые лаборатории сейчас работают с вариантами SARS-CoV-2, которые отличаются только одной аминокислотой. Они тестируются в лабораторных культурах клеток легких и дыхательных путей человека, а также на лабораторных животных, таких как хорьки и хомяки. Первое из этих исследований, проведенное исследователями в медицинском отделении Техасского университета в Галвестоне, было опубликовано в препринте 2 сентября. Было установлено, что вирусы с мутацией были более контагиозными, чем D-вирусы в линии легочных клеток человека и тканях дыхательных путей и что мутировавшие вирусы присутствовали в более высоких концентрациях в верхних дыхательных путях инфицированных хомячков.
Но эти эксперименты пока могут не внести абсолютной ясности. Часть исследований показывает, что некоторые мутации белка спайка в вирусе ближневосточного респираторного синдрома (MERS) могут вызвать более тяжелое заболевание у мышей, однако другие мутации белка показывают очень слабый эффект у людей или у верблюдов - вероятного резервуара для человеческих MERS инфекций, говорит Стэнли Перлман, коронавиролог из Университета штата Айова в Айова-Сити.
Самый явный признак того, что D614G оказывает влияние на распространение SARS-CoV-2 у человека появился в результате амбициозной британской акции под названием COVID-19 Genomics UK Consortium, которая провела анализ геномов около 25 000 образцов вируса. На основе этих данных исследователи выявили более 1300 случаев проникновения вируса в Соединенное Королевство и его распространения, включая примеры вирусов D- и G-типа.
Группа под руководством Эндрю Рамбо, эволюционного биолога Эдинбургского университета (Великобритания), эпидемиолога Эрика Вольца из Имперского колледжа Лондона и биолога Томаса Коннора из Кардиффского университета, изучила распространение в Великобритании 62 кластеров КОВИД-19 с вирусами типа D и 245 кластеров вирусов типа G7. Исследователи не обнаружили клинических различий между людьми, инфицированными ни тем, ни другим вирусом. Тем не менее, G-вирусы имели тенденцию распространяться немного быстрее, чем исходные, не несущие мутаций, и образовывали более крупные кластеры инфекций. По словам Вольца, их оценка разницы в скорости передачи вируса может составлять около 20%, но истинное значение может быть немного выше или ниже. "В абсолютном выражении нет большой разницы", - говорит Рамбо.
Возможно, что D614G является адаптацией, которая помогает вирусу инфицировать клетки или конкурировать с вирусами не несущими изменений, при этом мало меняя способ распространения SARS-CoV-2 между людьми говорит Рамбо. "Это может быть адаптацией к человеку или к некоторым человеческим клеткам, - соглашается Грубо, - но это ничего не значит". Адаптация не делает ее более трансмиссивной".
Грубо считает, что D614G получил слишком много внимания со стороны ученых, отчасти из-за резонансных работ. "Ученые безумно увлечены этими мутациями", - говорит он. Но он также рассматривает D614G как способ больше узнать о вирусе безотносительно генетического разнообразия. "Вирусолог во мне смотрит на эти вещи и думает, что изучать их было бы очень интересно", - говорит он. "Это кроличья нору из разных загадок, которые можно изучить."
Интенсивное изучение D614G должно помочь объяснить, как SARS-CoV-2 прикрепляется к клеткам, говорит Лубан - процесс, который может быть заблокирован лекарствами или вакциной. В обновленной версии своих псевдовирусных экспериментов, размещенной на сайте BioRxiv 16 июля, исследователи использовала криоэлектронную микроскопию для анализа структуры белков-шпионов, несущих изменение D614G. Спайковый белок состоит из трех идентичных пептидов в "открытой" или "закрытой" ориентации. Предыдущие исследования показали, что по крайней мере два из трех пептидов должны быть открыты для вирусной частицы, чтобы слиться с клеточной мембраной и команда Лубана обнаружила, что вирусы, несущие вариант шипа G гораздо с большей вероятностью находятся в этом состоянии. Работа по компьютерному моделированию, выполненная Монтефиори и Корбер, пришла к тому же выводу. "Похоже, что эта молекулярная машина работает иначе, чем вариант D", - говорит Лубан.
Структура белка шипа согласно данным K. Shen & J. Luban
Пока от антител не убежать
Большинство имеющихся данных свидетельствуют о том, что D614G не препятствует нейтрализующим антителам иммунной системы распознавать SARS-CoV-2, о чем беспокоился Монтефиори. Это может быть связано с тем, что мутация не происходит в рецепторно-связывающем домене (RBD) белка шипа - области-мишени для многих нейтрализующих антител: RBD связывается с клеточно-рецепторным белком ACE2, что является ключевым этапом при проникновении вируса в клетки.
Но появляются доказательства того, что другие мутации могут помочь вирусу избежать некоторых антител. Группа под руководством вирусологов Теодоры Хацциоанну и Пола Бениаша из Университета Рокфеллера в Нью-Йорке генетически модифицировала вирус везикулярного стоматита - возбудителя болезни домашнего скота таким образом, что он использовал белок шипа SARS-CoV-2 для заражения клеток, и вырастила его в присутствии нейтрализующих антител. Их цель состояла в отборе для мутаций, которые позволяли белку спайка уклоняться от распознавания антителами. В ходе эксперимента были получены мутанты белков шипа, устойчивые к антителам, взятым из крови людей, выздоровевших от КОВИД-19, а также к высокоэффективным моноклональным антителам, которые в настоящее время разрабатываются в качестве терапевтических средств. Каждая из мутаций шипа была найдена при секвенировании вирусов, изолированных от пациентов, сообщают Хацциоанну и Бениаш, хотя с невысокой частотой, что еще не позволяет мутациям стать более распространенными.
Другие ученые пытаются опередить эволюцию SARS-CoV-2, предсказывая, какие мутации могут быть важны. Джесси Блум, эволюционный вирусолог из Центра изучения рака им. Фреда Хатчинсона в Сиэтле, штат Вашингтон, возглавил группу, которая создала почти 4000 мутировавших версий RBD белка шипа и проанализировала как эти изменения повлияли на экспрессию белка шипа и его способность связываться с ACE2. Большинство мутаций не влияли на эти свойства и не препятствовали им, хотя некоторые из них улучшили их. Некоторые из этих мутаций были выявлены у людей с КОВИД-19, но команда Блума не обнаружила признаков естественного отбора ни для одного из вариантов.
Исследователи не проверяли, позволяют ли мутации вирусу препятствовать действию антител, но результаты позволяют предположить, что такие это возможно. "Это возможность, но отнюдь не уверенность в том, что вирус получит мутации, которые изменят его восприимчивость к антителам и иммунитету", - говорит Блум.
Основываясь на опыте работы с другими коронавирусами, это может занять годы. Исследования распространенных "простудных" коронавирусов, отобранных в течение нескольких сезонов, выявили некоторые признаки эволюции в ответ на иммунитет. Но темпы изменений медленные, говорит Фолькер Тил, вирусолог из Института Вирусологии и Иммунологии в Берне. "Эти штаммы остаются более или менее постоянными".
Поскольку большая часть мира все еще восприимчива к SARS-CoV-2, маловероятно, что иммунитет в настоящее время является основным фактором эволюции вируса. Но по мере роста иммунитета в масштабах всего населения, будь то в результате инфекции или вакцинации, стабильная струйка мутаций, позволяющих уклониться от иммунитета, может помочь вирусу SARS-CoV-2 закрепиться навсегда, говорит Шейхан, вызывая в основном легкие симптомы, когда он заражает людей, которые имеют некоторый остаточный иммунитет от предыдущей инфекции или вакцинации". "Я не удивлюсь, если этот вирус сохранится по типу более распространенного, "простудного" коронавируса". Но также возможно, что наши иммунные реакции на коронавирусные инфекции, в том числе на SARS-CoV-2 не достаточно сильны или долговечны, чтобы создавать селекционное давление, которое приводит к значительному изменению штаммов вируса.
Мутации, вызывающие беспокойство, также могут стать более распространенными, если терапия антителами не будет применяться разумно - если, например, пациенты с КОВИД-19 получают только одно антитело, которое может быть блокировано одной вирусной мутацией. Коктейли моноклональных антител, каждый из которых может распознать несколько областей белка шипа, могут уменьшить вероятность того, что такая мутация будет благоприятна для естественного отбора, говорят исследователи. Вакцины вызывают меньше беспокойства по этому поводу, потому что, как и естественный иммунный ответ организма, они, как правило, содержат ряд антител.
Возможно даже, что мутация D614G может сделать вирус более легкой мишенью для вакцин, что обнаружила команда Монтефиори в исследовании, опубликованном в BioRxiv в июле. Мыши, обезьяны и люди, получившие одну из экспериментальных РНК-вакцин, в том числе вакцину, разрабатываемую Pfizer, вырабатывали антитела, которые оказались более мощными в блокировании G-вирусов, чем D-вирусов.
В отношении вирусов G, которые сейчас повсеместно распространены, это "хорошие новости", говорит Монтефиори. Но как ученый, который наблюдал за тем, как ВИЧ мутирует, уклоняясь от многих вакцин, разработанных против него, он по-прежнему опасается, что SARS-CoV-2 может избежать ответных мер со стороны человечества. Лубан согласен: "Мы должны держать глаза открытыми".
