Многоцелевые экраны Cas13 помогают исследователям избежать необратимых повреждений ДНК и избежать истощения Т-клеток.
Многие основополагающие исследовательские технологии изменили клеточную терапию, продвинув ее от концепции до клиники. За последнее десятилетие химерные антигенные рецепторы (CAR) и редактирование генома - две наиболее яркие технологии, которые привели к созданию прорывных CAR T-клеточных терапий для лечения лейкемии и лимфомы. Ученые разрабатывают эти методы лечения с помощью опосредованной вирусами вставки генов ex vivo, что заставляет T-клетки экспрессировать синтетические рецепторы, которые обнаруживают специфические для опухоли антигены и направляют уничтожение раковых клеток после трансплантации.
Исследователи изучают редактирование с помощью кластерных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR), чтобы улучшить CAR терапию T-клеток и расширить ее применимость к большему числу типов рака. Однако инструменты для резки генома на основе CRISPR-ассоциированной нуклеазы 9 (Cas9) имеют уникальные ограничения по безопасности и эффективности в связи с постоянной природой изменения ДНК.
Чтобы обойти эти ограничения, биоинженер Стэнли Ци и врач-иммунолог Кристал Маколл из Стэнфордского университета разработали инструмент для редактирования РНК под названием мультиплексированные эффекторные направляющие массивы (MEGA). В исследовании, опубликованном в журнале Cell, команда использовала двоюродную сестру Cas9, Cas13, и объединенный массив направляющих РНК для одновременного редактирования транскриптов нескольких генов в первичных человеческих Т-клетках, не нацеливаясь на геномную ДНК и не разрезая ее. Этот метод мультитаргетинга решает проблему оптимизации клеточной терапии, позволяя исследователям динамически регулировать несколько механизмов в каждой Т-клетке, а не добавлять или удалять отдельные гены по одному за раз. Исследователи провели скрининг генов, которые синергически влияют на функции Т-клеток, и отключили избыточные транскрипты, которые приводят к истощению Т-клеток в культуре и у мышей.
"Наш многолетний опыт редактирования генов на уровне ДНК позволяет нам понять, что эта технология, хотя и очень мощная, все же имеет ряд присущих ей проблем, которые, возможно, удастся решить, только если мы найдем методы инженерии РНК", - говорит Ци. Среди этих трудностей - внецелевые разрезы и накопление геномной нестабильности в результате множественного редактирования ДНК. "РНК - это совершенно другое. Если мы нацеливаемся на РНК, мы не трогаем всю ДНК, и редактирование РНК обратимо", - объясняет Ци. Еще одним преимуществом Cas13 является способность обрабатывать несколько уникальных направляющих РНК из одного массива, что позволило исследователям нацеливаться сразу на несколько РНК-транскриптов в одной клетке.
Сначала исследовательская группа испытала MEGA в культуре клеток. Чтобы проверить этот метод, они нацелились сразу на три ранее установленных ингибитора функции Т-клеток, что позволило эффективно подавить истощение Т-клеток. Ученые также провели крупномасштабный комбинаторный скрининг с использованием множества направляющих матриц, выявила новые генетические регуляторы функции Т-клеток и создала лекарственно-индуцируемую форму MEGA для дозозависимой активации CAR. Затем они использовали MEGA для повышения пригодности CAR T-клеток и противоопухолевой активности в совместных культурах раковых клеток и в мышиной модели лейкемии путем нарушения нескольких компонентов метаболического пути в T-клетках перед трансплантацией.
"Это прекрасная статья. Она добавляет еще одно измерение к тому, что мы уже смогли сделать с помощью ДНК-мишеней CRISPR, используя преимущества этой превосходной платформы РНК-мишеней CRISPR", - считает Невилл Санджана, биоинженер из Нью-Йоркского университета, который не принимал участия в этом исследовании.
"Нам нужен широкий набор геномных технологий. Cas9 и Cas13 - отличные методы, но возможность включать и выключать гены и делать это мультиплексно - вот то будущее, которого мы действительно хотим".
В этом будущем могут появиться новые возможности для контроля истощения Т-клеток, что еще больше укрепит CAR T-терапию и другие методы лечения на основе иммунных клеток, особенно при лечении солидных опухолей. Результаты исследования Ци и Макколла показали, что метаболическая сигнализация является потенциальным модифицируемым путем, вовлеченным в истощение Т-клеток, что выходит за рамки традиционного фокуса на активации CAR. "Я думаю, что сейчас возникает возможность "CAR плюс" - не просто введение CAR, а способность делать другие вещи с Т-клетками, чтобы сделать их более стойкими и более эффективными", - говорит Санджана. "Я думаю, что способ, который продемонстрировали Стэнли и коллеги, как раз и является частью этого будущего".
