Для манипулирования микробиомом исследователи разработали систему доставки CRISPR, которая точно нацелена на бактерии в кишечнике мышей.
За последние 25 лет исследователи многое узнали о наших микробных спутниках и собрали горы данных благодаря достижениям в технологии секвенирования. Но у ученых до сих пор нет эффективных методов изменения микробиома на основе этой информации. Внедрение новых микроорганизмов с помощью добавок или фекальных трансплантатов не принесло особого успеха, поскольку новым бактериальным жителям трудно закрепиться в переполненном, устоявшемся сообществе. Уничтожение патогенов с помощью антибиотиков также приводит к сопутствующему повреждению доброкачественных бактерий и может привести к резистентности к лекарствам у выживших.
"Не хватает точности в том, как мы можем манипулировать микробиомом", - говорит Питер Тернбо, доцент Калифорнийского университета в Сан-Франциско, чья исследовательская группа недавно разработала систему изменения микробиома с помощью технологии редактирования CRISPR-Cas9. "Это действительно послужило стимулом для поиска инструмента, с помощью которого мы могли бы вносить более конкретные изменения".
In vitro ученые удаляют гены или убивают клетки, вызывая двухцепочечные разрывы ДНК в целевых последовательностях с помощью нуклеазы Cas, входящей в состав CRISPR. Как описано в недавнем исследовании Cell Reports, сотрудники Тернбо разработали точный способ изменения микробиома in vivo с помощью CRISPR, по одному бактериальному штамму или гену за раз.
"Подход, безусловно, очень интересный, и... область пытается перейти к конкретным, хирургическим модификациям микробиома", - сказал Майкл Циммерманн, руководитель группы в Европейской лаборатории молекулярной биологии, который не участвовал в этом исследовании. "Совершенно ясно, что микробиом имеет связь со здоровьем и заболеваниями, и мы должны его регулировать".
Хитрость использования CRISPR для изменения микробиома организма заключалась в том, чтобы найти способ доставить его в интересующие бактерии - в данном случае в микробиоту кишечника мыши. Для этого Тернбо обратился к бактериофагам, которые имеют особые отношения с бактериями, которые они заражают; большинство фагов заражают только один вид или штамм бактерий. В то время как некоторые из них убивают клетку при инфицировании, нитчатые фаги, такие как M13, использованный в данном исследовании, применяют более мягкий подход и могут быть использованы для доставки генетического груза в организм хозяина. Исследователи решили снабдить фагов плазмидами, содержащими систему CRISPR, разработанную для нацеливания на определенную последовательность ДНК.
Для визуализации работы CRISPR ученые сконструировали систему таким образом, чтобы она нарушала локус бактериального гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP). Перед обработкой фагом ученые колонизировали мышей штаммом E. coli с GFP и красным флуоресцентным штаммом (mCherry) в качестве контроля. В последующих экспериментах исследователи использовали один штамм бактерий, содержащий оба гена флуоресценции. Затем они перорально вводили фаги мышам, отправляя их взаимодействовать с E. coli в кишечнике. Группа Тернбо ожидала, что система CRISPR разрежет геном бактерии в локусе GFP, что приведет к гибели большинства клеток, не способных восстановить повреждения.
Чтобы определить успешность эксперимента, исследователи выделили бактерии из образцов стула мышей и проанализировали флуоресценцию. В целом, бактериофаг, несущий CRISPR, убил большинство GFP-содержащих бактерий в кишечнике мыши. В выживших бактериях, собранных из стула, исследователи обнаружили много красных флуоресцирующих клеток и мало зеленых и нефлуоресцирующих кишечных палочек. Полногеномное секвенирование показало, что выжившие бактерии, зараженные фагом и потерявшие зеленое свечение, имели большие делеции в гене GFP, возникшие в результате неточной репарации двунитевых разрывов ДНК, вызванных Cas9. Это показывает, что в большинстве случаев фаги находили свои метки и доставляли груз CRISPR, который нацеливался и расщеплял нужную последовательность.
Тернбо рассматривает эту работу как инструмент, который исследователи смогут использовать в лабораторных условиях. Точно редактируя геномы бактерий in vivo, они смогут понять важные механизмы, определяющие здоровье и заболевания, связанные с микробиомом и патогенными микробами.
В настоящее время команда Тернбо решает проблемы, связанные с ограничениями системы. В частности, мышиная модель не имитирует кишечник человека - исследователи лечили мышей антибиотиками по нескольким причинам, включая уничтожение микробиома кишечника, чтобы освободить место для флуоресцентной кишечной палочки. Кроме того, по словам Циммерманна, еще одним ограничением является то, что единственными тестируемыми бактериями были E. coli - проблема, которую Тернбо надеется решить в будущем.
"У нас есть тонны данных со всего мира о разнообразии бактериофагов в кишечнике, но у нас нет действительно хорошо изученных пар бактерий и вирусов, таких как M13 и E. coli", - говорит Тернбо. "Одна из главных задач на будущее - выявление других пар. Мы хотели бы иметь больше фагов, которые были бы нацелены на других членов сообщества, в идеале таким образом, чтобы они не были специфичны для конкретного штамма".
Кроме того, система не является надежной, поскольку исследователи видели в фекалиях бактерии, которые избегали атаки CRISPR. "Бактерии - это потрясающие беглецы. У них есть способы уклониться от того, что вы пытаетесь сделать", - говорит Кэти Тэм, первый автор статьи. "Вы делаете двухцепочечный разрез. Но нет ничего странного в том, что они могут исправить это так, чтобы выжить, или мутировать систему CRISPR-Cas".
Доказательства того, что бактерии восстанавливают свою ДНК, заставили исследователей рассматривать эту систему не как антимикробное средство, предназначенное для уничтожения бактерий, а как способ понять и изменить патогены или микробиоту путем нарушения целевых генов. "Если в вашем кишечнике есть организмы, которые расщепляют молекулы, важно понять их деятельность. И если они нежелательны, вы можете удалить конкретный ген, который выполняет эту деятельность", - объясняет Тэм. Помимо удаления нежелательных бактерий или генов, эта система доставки фагов может доставлять желательные гены жителям микробиоты, что открывает множество возможностей. "Альтернативная стратегия, о которой мы думаем, - это... усиление функций", - сказал Тернбо.
"В идеале мы хотим добавить в кишечную палочку функции, полезные для бактерии и имеющие отношение к болезни... Мы хотим попытаться сотрудничать с кишечной палочкой, чтобы сделать кишечник более здоровым".
