Молекулярный клей "измельчает" Cas9 и позволяет использовать новую форму CRISPR-контроляМолекулярный клей "измельчает" Cas9 и позволяет использовать новую форму CRISPR-контроля
В попытке решить проблемы безопасности, связанные с иммунными реакциями во время лечения препаратами на основе CRISPR, новый метод ускоряет процесс разрушения организмом ДНК-режущего фермента Cas9.
Революционные клинические испытания, которые могут привести к созданию новых мощных CRISPR-методов лечения ВИЧ, генетической слепоты и других заболеваний, уже начались, но некоторые опасения по поводу безопасности остаются. Одно из опасений заключается в том, что если CRISPR будет введен непосредственно в организм пациентов, у них может возникнуть серьезная иммунная реакция на Cas9, фермент бактериального происхождения, который разрезает ДНК.
В недавнем препринте была опубликована методика, разрушающая Cas9 в результате действия препарата, одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), и исследователи, разработавшие ее, надеются, что в конечном итоге она может быть использована в качестве "выключателя" CRISPR в случае плохой реакции.
"Когда вы помещаете бактериальную систему в человеческое тело, это немного рискованно, потому что иммунная система просто сходит с ума", - объясняет Амит Чоудхари из Broad Institute, который руководил работой. "Нам нужно нечто, что при неблагоприятном сценарии полностью отключит [систему] или снизит ее эффективность". Чтобы добиться такого контроля, Чоудхари и его коллеги добавили к ферменту Cas9 специальный реагирующий элемент и ввели препарат помалидомид, который действует как молекулярный клей для объединения белков, которые иначе не взаимодействовали бы. В данном случае помалидомид привел реагирующий элемент в контакт с белком, который пометил его и Cas9 для уничтожения собственным убиквитин-протеасомным механизмом уничтожения в клетке.
За счет этого Cas9 был разобран - или "измельчен", как это называет Чоудхари, - протеасомой. Доза помалидомида контролировала как быстро это происходило, задавая период полураспада Cas9. В культивируемых клетках концентрация в один микромоль очищала генный редактор в течение тридцати минут, а обычно этот процесс занимает 24 часа. Поскольку помалидомид является препаратом, одобренным FDA, Чоудхари планирует, что в долгосрочной перспективе пациенты смогут принимать таблетки, чтобы контролировать, как долго Cas9 будет оставаться в их организме.
Команда повторила подход с базовыми и эпигенетическими редакторами, использующими другие версии Cas9, предполагая, что он может быть использован с большинством редакторов на основе CRISPR. Важно, что результаты показали, что сокращение периода полураспада Cas9 привело к пропорционально меньшему количеству правок в нежелательных местах, известных как внецелевые эффекты, и что "клей" может снизить активность редактирования при использовании на мышах.
Карен Максвелл из Университета Торонто, которая не принимала участия в работе, считает, что метод "молекулярного клея" - умная идея, но трудно судить, лучше ли он других платформ управления или эквивалентен им. "Они избавились от внецелевых эффектов, но при этом сократилось и редактирование по мишени", - отметила она. "Если у нас намного меньше редактирования, то по определению у вас будет намного меньше внецелевых эффектов".
Однако подход Чоудхари выделяется своей способностью разрушать Cas9. Другие аналогичные способы контроля активности CRISPR, такие как анти-CRISPR, ингибиторы малых молекул и деактивация светом, обычно блокируют Cas9, а не уничтожают его. По словам Чоудхари, этого, вероятно, будет недостаточно, если у пациента возникнет иммунная реакция. Более того, некоторые из таких пациентов могут сами представлять иммунную угрозу.
Это важный момент, соглашается Эрик Сонтхаймер из Массачусетского университета, который также не принимал участия в работе. "[Иммунный риск, связанный с Cas9], еще не установлен, но он, конечно, существует, - говорит он. И есть некоторые свидетельства того, что это может стать проблемой": так. в исследовании 2019 года сообщалось, что большинство из 125 участников имели уже существующий иммунитет к Cas9, что означает, что их иммунная система может отреагировать на терапию CRISPR-Cas9, проводимую in vivo.
Такой иммунитет - это не просто проблема безопасности; он может повлиять на эффективность терапии. Исследование на мышах, проведенное в 2018 году, показало, что уже существующий иммунитет к Cas9 в конечном итоге привел к полному уничтожению отредактированных клеток. По словам Эйвери Августа, иммунолога из Корнельского университета, то же самое может произойти и у людей. "Если иммунная система мобилизована, то некоторые Т-клетки в иммунном ответе могут в значительной степени уничтожить клетки [несущие Cas9], оказывая ослабляющий эффект", - заявил он.
Является ли измельчение средством решения потенциальных иммунных рисков Cas9, еще предстоит выяснить. С точки зрения Августа, только люди без уже существующего иммунитета, вероятно, смогут извлечь из него пользу, потому что путь деградации, который использует этот метод, тот же самый, который используется для предоставления иммунной системе фрагментов чужеродного материала. Другими словами, измельченные кусочки Cas9 могут увеличить риск запуска иммунной системы, если у человека есть иммунитет. Для людей, у которых его нет, по его мнению, "если вы разрушаете ферменты достаточно быстро, так, что у вас не остается времени на выработку иммунитета, то это может иметь благоприятный эффект".
В этом случае клей будет меньше похож на "выключатель" и больше на шапку-невидимку.
