Инструменты, основанные на CRISPR, не могут легко получить доступ к ДНК в митохондриях, но исследователи находят другие способы.
Редактирование генов с помощью CRISPR проникло во все уголки современной биологии, но не в каждый уголок клетки. Хотя исследователи использовали эти системы для разработки методов лечения серповидноклеточной анемии и рака крови, для раскрытия секретов многоклеточности и роли тысяч белков, есть одно место, куда CRISPR нелегко добраться - это митохондрии. Кольца ДНК внутри митохондрий недоступны для этих методов, а это означает, что точные изменения митохондриальной ДНК (мтДНК) остаются, к сожалению, недоступными. “Революция CRISPR–Cas9, которая произошла 12 лет назад”, не коснулась митохондрий", - поясняет Михал Минчук, генетик из Кембриджского университета, Великобритания.
Тем не менее, исследователи стремятся получить доступ к этой ДНК. Митохондрии - это органеллы в форме бобов, которые питают клетки и выполняют множество других клеточных задач. Изучение их ДНК важно для понимания процессов производства и обмена энергии, лежащих в основе метаболического здоровья. И более 300 мутаций в этой ДНК вызывают митохондриальные заболевания — неизлечимые генетические нарушения с широким спектром симптомов, которые могут лишить людей зрения и слуха, привести к проблемам с мышцами и вызвать судороги. Этими нарушениями страдает примерно 1 из 5000 человек.
Поскольку CRISPR не может помочь с этими проблемами, исследователи ищут другие способы точного редактирования митохондриального генома. И последние несколько лет принесли определенные успехи: инструменты уже доказали свою эффективность при создании точных моделей митохондриальных заболеваний на животных. “Ощутимый прогресс есть”, - говорит Джин-Су Ким, биолог-химик, разрабатывающий инструменты для редактирования мтДНК в Корейском институте передовых наук и технологий, Южная Корея. Если исследователи смогут сделать редактирование мтДНК достаточно безопасным и точным, то в конечном итоге его можно будет использовать для лечения этих генетических заболеваний. “Это был бы прорыв в медицине”, - уверен Ким.
Точное происхождение митохондрий неясно, но ведущая теория гласит, что история этой органеллы началась около 1,5 миллиардов лет назад, когда одноклеточный микроорганизм под названием археон поглотил бродячую бактерию, которая выжила внутри своего хозяина. Это событие положило начало эукариотам — большой группе организмов, включающей растения, животных и грибы, клетки которых содержат органеллы, заключенные внутри мембран. Проглоченная бактерия сохранила свою характерную кольцевидную ДНК, когда поселилась в своем новом доме, но со временем она пожертвовала большинством своих генов ради ядерного генома своего хозяина. В эволюционной линии, давшей начало людям и другим животным, этот генетический перенос сократил геном бактерии-резидента всего до 37 генов, которые кодируют 13 белков, участвующих в производстве энергии, превратив ее в специализированную органеллу.
Небольшое количество митохондриальной ДНК, которое сохранилось у животных, существенно отличается от ядерной ДНК, которая у человека кодирует около 20 000 генов. Начнем с того, что мтДНК обычно наследуется исключительно от матери. В каждой митохондрии может быть несколько копий мтДНК и органелла имеет свой собственный встроенный механизм для производства РНК и белков из этой ДНК. Митохондриальная ДНК также гораздо более подвержена ошибкам и частота мутаций в ней, по оценкам, в 10-20 раз выше, чем в ядерной ДНК. Отчасти это связано с тем, что ей приходится бороться со множеством опасных активных форм кислорода — нестабильных молекул, которые образуются в митохондриях при нормальном производстве энергии. Но это также потому, что в ней нет гистонов: белков, которые защищают и упаковывают ядерную ДНК.
По сравнению с аналогом в ядре, набор инструментов мтДНК для самовосстановления является рудиментарным. Ядро быстро восстанавливает поврежденную цепочку ДНК, используя целый арсенал механизмов репарации, но митохондрии могут исправить только некоторые дефекты. Часто они просто выбрасывают свою поврежденную ДНК. Это различие ограничивает возможности инструментов для редактирования генов, поскольку почти все подобные инструменты для работы с ядерной ДНК используют присущие ей пути репарации.
Разработка подходов к модификации митохондриальной ДНК сложная задача, отмечает Стивен Эккер, молекулярный биолог из Техасского университета. “Ее бактериальное происхождение становится очевидным, когда вы начинаете пытаться ее редактировать”, - говорит он. Самым серьезным препятствием для ученых, пытающихся поработать с митохондриальным геномом, является то, что он заперт за стеной мембран, которая не позволяет внешним нуклеиновым кислотам проникать в органеллу. Хотя были надежды на то, что метод Crispr сможет преодолеть эти барьеры, многие ученые остаются при своем мнении. Тем не менее, есть и другие способы. Более чем за десять лет до создания CRISPR, исследователи митохондрий начали экспериментировать с другими инструментами редактирования, которые могли бы проникать через мембраны митохондрий и заставлять органеллы удалять проблемную ДНК.
Каждая клетка содержит огромное количество митохондриальных геномов, потому что клетки содержат тысячи митохондрий, и каждая из них может содержать несколько копий мтДНК. Здоровая и мутировавшая мтДНК часто сосуществуют: это состояние известно как гетероплазмия. Именно тогда, когда доля мутировавшей мтДНК достигает 60-80% в определенной ткани или типе клеток, проявляются митохондриальные заболевания. Если бы исследователям удалось уменьшить количество дефектных копий мтДНК в клетках, они могли бы устранить возникающее в результате заболевание. Поэтому они обратились к ферментам, называемым нуклеазами цинкового пальца (ZFNs), и эффекторным нуклеазам, подобным активаторам транскрипции (TALENs), чтобы расщепить двухцепочечную мтДНК. В то время как целенаправленное удаление ядерной ДНК заставляет отрезанные нити ДНК склеиваться обратно без вредных мутаций, отрезанная ДНК в митохондриях просто выбрасывается. Это удаление заставляет оставшиеся неповрежденные копии реплицироваться, чтобы поддерживать необходимый уровень мтДНК. В большинстве случаев количество мутировавших копий уменьшается до приемлемого уровня по мере размножения нормальных копий. “Это компенсирует то, что вы уничтожаете”, - пояснят Карлос Мораес, генетик из Университета Майами.
Несмотря на определенный прогресс в применении этого подхода, он еще не вышел за рамки лабораторных исследований. И даже если бы этот метод попал в клинику, он был бы бессилен против заболеваний, вызванных мутациями, которые часто присутствуют во всех копиях мтДНК человека, таких как наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON), редкое заболевание, вызывающее быструю потерю зрения. Исследователям нужны методы, которые позволяют не только вырезать ДНК, но и не полагаются на направляющую РНК.
Когда в 2012 году CRISPR–Cas9 появился в качестве инструмента, он стал универсальным редактором генов для всех видов применения. Направляющая РНК направляет фермент Cas9 к определенной последовательности ДНК, где фермент выполняет обработку. Генетические изменения происходят по мере того, как ДНК восстанавливает саму себя. Этот подход стал еще более полезным в 2016 году, когда Дэвид Лю, биолог-химик из Массачусетского технологического института, и его коллеги представили более точную методику, получившую название редактирование оснований. В данном случае исследователи модифицируют фермент Cas9 и используют другой фермент, называемый дезаминазой, для преобразования одной буквы ДНК в другую, например, цитозина (C) в тимин (T) или аденина (A) в гуанин (G).
Хотя редактирование оснований и другие методы CRISPR были применены для ядерной ДНК, Лю и другие исследовательские группы не смогли применить их к мтДНК. Поскольку направляющая РНК CRISPR с трудом проходит через двойную мембрану митохондрий, использование точных инструментов для работы с мтДНК оставалось несбыточной мечтой. “Мы не добились особого успеха”, - рассказывает Лю. Решение было найдено в 2018 году, когда Джозеф Мугус, микробиолог из Вашингтонского университета, и его коллеги наткнулись на токсин, вырабатываемый бактерией Burkholderia cenocepacia. Этот фермент, смертоносное оружие против других бактерий, сеет хаос, в конечном счете превращая нуклеотид С в Т во всем бактериальном геноме. Мугус, который сейчас работает в Йельском университете, отправил Лю электронное письмо с вопросом, может ли фермент, называемый DddA, быть ему полезен. “Я точно знал, для чего он может быть использован — для редактирования мтДНК!” - говорит Лю.
Но замена каждой буквы "С" на "Т" была бы смертельна для клеток. Лю и его коллеги решили “приручить зверя”. Они разделили DddA на две неактивные части, так что фермент мог выполнять свою работу с мтДНК только тогда, когда эти части были собраны вместе в определенной ориентации. И вместо использования направляющей РНК Лю и его коллеги модифицировали белки, обнаруженные в TALENs, чтобы направить сегменты DddA к их целевым последовательностям. Используя свой редактор оснований мтДНК, Лю и его группа внедрили пять митохондриальных мутаций в клетки человека в лаборатории. Прилив адреналина, вызванный выполнением такого технического задания, до сих пор ощущает Беверли Мок, биолог-химик, которая была аспиранткой в команде, а сейчас работает в Агентстве науки, технологий и исследований (A*STAR) в Сингапуре. “Этот момент ”ух-ты", когда вы обнаруживаете что-то, что когда-то считалось трудным или невозможным, действительно является одним из самых полезных в исследованиях", - рассказывает Мок.
Но этот редактор оснований мтДНК мог изменить только C на T, оставив другие нуклеотиды нетронутыми. В 2022 году Ким и его коллеги создали другой редактор, который изменил A на G, что позволило устранить более 40% известных патогенных мутаций в мтДНК. Инструмент Кима использует DddA в сочетании с другим инженерным ферментом, полученным из бактерий Escherichia coli, и, как и редактор C-на-T, использует индивидуальные белки вместо РНК для связывания с определенными участками ДНК. В настоящее время группа разработчиков адаптирует редактор A-на-G для выявления мутаций, лежащих в основе митохондриальных заболеваний, включая LHON; синдром МЕLAS, поражающий несколько органов; и болезнь Ли, тяжелое неврологическое расстройство, вызывающее судороги.
Но для большей универсальности в лабораторных условиях и в конечном итоге полезности в клинике, исследователям необходимо разработать точные редакторы, нацеленные на еще более широкий набор мутаций, говорит Сабина Фукс, педиатр, специализирующаяся на митохондриальных заболеваниях в Университетском медицинском центре Утрехта в Нидерландах. “По-прежнему существует лишь определенная группа мутаций, которые мы можем исправить”, - говорит она. Исследователи также сосредоточены на предотвращении внесения изменений в ДНК редакторами оснований, не относящимися к их целевым последовательностям, что частично будет зависеть от лучшего понимания того, как эти редакторы организуют переключение.
Уже ведется работа по использованию этих редакторов для разработки животных моделей митохондриальных заболеваний. В январе Сяосюэ Чжан, биолог из Пекинского университета, и ее коллеги доработали существующие редакторы оснований и использовали их для создания двух моделей мышей — одной с болезнью Ли, при которой у мутировавших животных снижена частота сердечных сокращений, как у людей, страдающих этим заболеванием, и другим заболеванием - LHON, при которой мыши слепнут.
Несколько месяцев спустя Лян Чен, биолог из Восточно—Китайского педагогического университета в Шанхае, и его коллеги использовали редактор для внесения мутации, вызванной болезнью Ли, в другой ген эмбрионов крыс, и разработали отдельный редактор, чтобы обратить мутацию вспять в следующем поколении. У крыс, родившихся с мутацией, развились слабые мышцы и аномалии сердца. Когда у потомства отредактированных крыс исправили это изменение, в среднем восстановилось более половины здоровой мтДНК, а симптомы у них уменьшились. Исследователи также рады возможности использовать редакторы оснований для ответов на основные вопросы о биологии митохондрий. Мораес и его коллеги, например, редактируют мтДНК, чтобы понять, как она экспрессирует длинные одиночные молекулы РНК, кодирующие множество белков, которые редко встречаются в ядерной ДНК. “Никто хорошо не понимает этот процесс”, - говорит Мораес.
Внедрение редактирования мтДНК в клинику сталкивается со многими из тех же препятствий, что и в случае с CRISPR. Помимо обеспечения безопасности и точности работы редакторов мтДНК у людей, исследователям необходимо разработать наилучший способ доставки их в соответствующие органы и клетки, говорит Фукс. По ее словам, митохондриальные заболевания поражают множество систем организма, и, хотя такие органы, как печень, относительно доступны, добраться до мозга, сердца и мышц сложнее.
Эти ограничения не помешали начинающим биотехнологическим компаниям разрабатывать инструменты редактирования мтДНК для лечения митохондриальных заболеваний. Компания Primera Therapeutics (США) специализируется на создании настраиваемых редакторов оснований для однобуквенных мутаций. Другие компании, в том числе Precision BioSciences, разрабатывают нуклеазы, которые изменяют степень гетероплазмии. Минчук и Ким также основали биотехнологические компании, специализирующиеся на митохондриальной терапии.
С момента появления CRISPR до первой одобренной терапии CRISPR в 2023 году прошло более десяти лет. Это препарат Casgevy, который предназначен для лечения серповидноклеточной анемии и связанного с ней заболевания крови - β-талассемии. Исследователи говорят, что внедрение редакторов митохондриальной ДНК в клинику, вероятно, займет не менее десяти лет. Но разрабатываемые модели заболеваний могут принести пользу людям, страдающим митохондриальными заболеваниями, гораздо раньше. Они помогают исследователям понять основы биологии этих заболеваний и позволят протестировать более целенаправленные методы лечения, не требующие редактирования генов. Мугус ожидает появления новых редакторов оснований мтДНК, которые предложат еще больше возможностей для работы с митохондриальным геномом. “Было приятно видеть, как наше первоначальное открытие в этой области переросло в самостоятельную область”, - говорит он.
