В результате «направленной» эволюции в лаборатории был создан инструмент редактирования, превосходящий классические системы CRISPR.
Инновационный инструмент для редактирования генома обещает сделать то, что с трудом удавалось первоначальным системам CRISPR: точно и эффективно вставлять целые гены в человеческую ДНК. Описанный на прошлой неделе в журнале Science, этот метод может проложить путь к генокорректирующим терапиям, которые будут назначаться однократно и работать независимо от конкретной мутации, вызывающей то или иное заболевание человека. Кроме того, он может ускорить разработку клеточных методов лечения рака и упростить создание генетических моделей для исследований. «Это может стать важной частью будущего», - считает соавтор исследования Дэвид Лю, химический биолог из Института Броуда (США).
Один из наиболее распространенных методов доставки генов основан на использовании сконструированных вирусов для вставки участков генетического материала в геном клетки. Несмотря на свою эффективность, эти вирусы, как правило, вставляют свою полезную нагрузку в случайном порядке, что чревато опасными нарушениями или слабым контролем над экспрессией генов. CRISPR обеспечивает больший контроль, чем вирусные носители, но обычно требует разрезания ДНК, что повышает вероятность нежелательных мутаций и неполного восстановления, или создания собственных шаблонов для каждой мутации, что ограничивает возможности его масштабирования.
Новая система позволяет обойти обе проблемы, внедряя полноразмерные гены в целевые участки за один шаг, не разрезая ДНК и не прибегая к индивидуальному дизайну. Метод, разработанный Лю, биохимиком Сэмюэлем Стернбергом из Колумбийского университета в Нью-Йорке и их коллегами, использует комплекс бактериальных ферментов под названием CRISPR-ассоциированная транспозаза, или CAST. Транспозазы - это ферменты, обеспечивающие перемещение «прыгающих генов» - «эгоистичных» участков ДНК, которые перемещаются по геному, чтобы распространить себя. Исследователи уже использовали системы CAST для перемещения больших кусков генетического материала в бактериальных клетках. Но в клетках человека и других млекопитающих все ранее описанные версии CAST работали с низкой эффективностью.
Чтобы преодолеть эти препятствия, Лю и Штернберг обратились к направленной эволюции - методу, позволяющему использовать силу дарвиновского отбора в лабораторных условиях. Они поместили ключевые гены, кодирующие компоненты системы CAST, в бактериофаги. При этом вирусы с наиболее эффективными версиями CAST - теми, которые быстро и точно интегрируют ДНК в геном, - росли лучше всего. Затем они позволили эволюции идти своим чередом.
После сотен поколений вирусов и рациональной инженерии некоторых компонентов CAST исследователи получили оптимизированную версию ферментного комплекса. Он содержал 21 небольшое изменение в пяти белках, составляющих архитектуру CAST. Это достижение раздвигает границы дизайна белков, отмечает Макото Сайто, биоинженер из компании RIKEN (Япония). «Это сумасшедшая направленная эволюция!» - подчеркивает он. Полученный комплекс, названный evoCAST, продемонстрировал эффективность вставки до 30% в нескольких геномных участках - более чем 400-кратное улучшение по сравнению с неэволюционировавшим оригиналом.
В лабораторных испытаниях evoCAST успешно интегрировал сегменты длиной более 10 000 нуклеотидов, достаточной для доставки целых генов и их управляющих элементов. Он работал в различных типах человеческих клеток, нацеливаясь на геномные «безопасные гавани», способные принять новую ДНК без нарушения клеточных функций, и устанавливая генетическую нагрузку в естественные места расположения нескольких генов, связанных с заболеваниями. Примечательно, что evoCAST доставляет свой генетический груз за один ферментативный шаг, не создавая двухцепочечных разрывов в геноме.
В последние месяцы другие исследовательские группы сообщили о своих собственных методах, основанных на транспозонах и предназначенных для установки массивных участков ДНК без разрезания генома. В апреле группа под руководством генных инженеров Джонатана Гутенберга и Омара Абудайе из Гарвардской медицинской школы (США), описала систему, основанную на типе мобильного генетического элемента, встречающегося в геномах птиц. Исследователи объединили механизм интеграции этого элемента с ферментом CRISPR, который нацеливается на ДНК, но не разрезает ее, создав инструмент, способный внедрять генные вставки в клетки человека.
Тем временем ученые из Metagenomi, американской биотехнологической компании, в марте сообщили о подходе, аналогичном evoCAST, но с использованием более простой транспозазной системы. Несмотря на более низкую эффективность вставки, эта система может быть более удобной для применения в терапевтических целях благодаря своей компактной конструкции.
По мнению Гутенберга, эти и другие достижения, представленные на недавней встрече Американского общества генной и клеточной терапии, означают переход к более безопасным и универсальным стратегиям редактирования, которые восстанавливают функции здоровых генов, сохраняя при этом окружающий генетический ландшафт: «Это действительно захватывающее время в разработке новых технологий», - говорит он, - «и мы надеемся, что это отразится на пациентах».
Ни одна из этих новых технологий не лишена недостатков. Например, при использовании evoCAST, несмотря на то, что исследователи обнаружили мало случаев нецелевого воздействия, некоторые непреднамеренные вставки все же происходили - хотя и редко. Большой размер механизма CAST с множеством движущихся частей также создает проблемы для упаковки и доставки. «Впечатляет, как далеко они зашли», - говорит Илья Финкельштейн, биофизик из Техасского университета. «Но эта система действительно сложна». Несмотря на это, разработка evoCAST и поиск других систем на основе транспозонов говорит о том, что эта область только начинает раскрывать потенциал этих систем для безопасной установки больших генетических нагрузок там, где они больше всего нужны, говорят ученые.
«В этом и заключается прелесть инженерии», - отмечает Стернберг. «Мы всегда можем сделать так, чтобы это работало лучше».
