Новая система одновременного редактирования генома
Одна единственная мутация в геноме человека может определять разницу между здоровьем и болезнью и с помощью редактирования оснований исследователи могут воссоздать эти мутации в лаборатории, чтобы изучить, как генетические изменения заставляют клетки сбиваться с пути.
Однако генетическая основа сложных заболеваний включает в себя множество мутаций, и существующие стратегии редактирования оснований не справляются с этой задачей. "Мы считаем, что очень важно функционально охарактеризовать конкретные комбинации мутаций", - пояснил Алексис Комор, химик из Калифорнийского университета. "Нам нужны методы для мультиплексного анализа".
К сожалению, мультиплексировать не означает просто собрать несколько наборов редакторов оснований, особенно если исследователи хотят одновременно вносить разные типы изменений: скажем, превращать цитозин в тимин в одном положении, а аденин в гуанин в другом. Механизм сложен и включает в себя фермент, который производит нужную модификацию основания, и направляющую РНК, которая ведет комплекс к нужному участку в геноме. Но когда одновременно работают несколько редакторов оснований, направляющая РНК, предназначенная для одного редактора оснований, может взаимодействовать с компонентами другого редактора оснований, приводя неправильный ферментный комплекс к целевому сайту и создавая неправильный тип изменений в этом сайте.
Чтобы решить эту проблему, группа Комора разработала четыре новых мультиплексных ортогональных базовых редактора (MOBE), которые позволяют исследователям вносить несколько типов правок одновременно, не опасаясь перекрестных помех между механизмами для каждой модификации. Эти системы, описанные в журнале Nature Biotechnology, открывают возможности для создания моделей для изучения сложных генетических заболеваний, вызванных множественными мутациями.
Исследователи использовали комплементарные пары молекул РНК и белка, называемые аптамерами и белками оболочки, которые избирательно связываются друг с другом. Встраивая РНК-аптамер в направляющую РНК, а белок оболочки - в соответствующий белковый комплекс редактора оснований, они заставляли правильные пары направляющей РНК и редактора оснований работать вместе и сводили к минимуму количество ошибочных пар. "Когда мы придумали эту идею, она была очень простой в теории", - рассказывает Комор. "Но заставить ее работать и осуществить всю белковую инженерию было непростой задачей".
Авторы протестировал сотни различных конфигураций РНК и белковых компонентов, пока не нашли оптимальный подход, позволяющий добиться максимальной специфичности правок и минимизировать перекрестные помехи, когда один редактор оснований вносит свои правки в целевую позицию другого редактора. Обычно при комбинировании редакторов оснований, нацеленных на аденины и цитозины, уровень перекрестных помех составляет 30%. Но при использовании MOBE перекрестные помехи снизились до 5%. При этом четверть клеток получали правильную пару правок.
"Я вижу много полезного в этой платформе", - считает Кришану Саха, инженер-биомедик из Университета Висконсин-Мэдисон, который не принимал участия в этом исследовании. "Что интересно в стратегии, разработанной этой группой, так это то, насколько она модульная". Систему можно использовать для множества различных типов базовых редакторов и даже настраивать ее, изменяя способ соединения различных компонентов. Саха также отмечает, что такая модульность может упростить доставку в клетки по сравнению с другими более громоздкими мультиплексными редакторами.
В то время как одни члены группы Комора улучшают работу ферментов для редактирования оснований, другие используют систему для создания генетических моделей сложных заболеваний, редактируя в клеточных линиях множество базовых мутаций. Например, в этом исследовании ученые использовали MOBE для редактирования пар мутаций, вызывающих синдром Каллмана, гормональное расстройство, и анэнцефалию, нейрорасстройство, в клеточных линиях. Затем они смогли изучить, как эти мутации влияют на характеристики клеток, например, на их транскрипционные профили или морфологию.
Саха с оптимизмом смотрит на потенциальные возможности применения MOBE в своей собственной работе по созданию клеточных терапий. Например, определенные мутации могут сделать Т-клетки более эффективными для иммунотерапии, а с помощью MOBE исследователи могут провести большой скрининг множества комбинаций мутаций, чтобы увидеть, какие из них дают наиболее перспективные с терапевтической точки зрения Т-клетки. "Расширение сферы применения моделирования заболеваний и клеточной инженерии, на мой взгляд, очень интересно", - говорит Саха. "Это выведет применение этих средств редактирования генома на новый уровень".
