Туберкулез был бичом человечества на протяжении тысячелетий: самые древние известные случаи заболевания обнаружены в паре скелетов 9000-летней давности.
Несмотря на современные методы лечения, болезнь поражает около десяти миллионов человек в год. Ее сложно как лечить, так и изучать в лабораторных условиях. Отчасти сложность заключается в том, что Mycobacterium tuberculosis обитает внутри иммунных клеток, которые организм использует для борьбы с ней. Поэтому любое лечение должно преодолеть клеточную мембрану, прежде чем попытаться атаковать бактерию, что является сложным маневром. Аналогичным образом, исследователи, изучающие взаимодействие хозяина и патогена, должны найти способы изучения бактерии в культивируемых клетках или на животных, чтобы уловить истинную сложность инфекции.
И это не только M. tuberculosis. Многие другие внутриклеточные патогены, включая Salmonella typhimurium, Chlamydia trachomatis и Listeria monocytogenes, лучше всего изучать в тандеме с клетками их хозяев. "В основном мы уделяем патогену столько же внимания, сколько и хозяину", - говорит Дэвид Рассел, биолог-инфекционист из Корнельского университета в Итаке, штат Нью-Йорк. "Я действительно считаю, что нельзя интерпретировать одно без другого".
В прошлом ученые, как правило, рассматривали инфицированные клетки в большом количестве, поскольку у них не было инструментов для их индивидуального изучения. Теперь Рассел и другие ученые объединяют разные методы, чтобы увидеть, как реакция клеток-хозяев на патогены и реакция патогенов на клетки-хозяева различается от клетки к клетке. Понимание инфекции на этом уровне может привести к созданию новых вакцин или методов лечения, а также добавить детали и нюансы к выводам, сделанным на основе анализа больших массивов клеток. "В этой области мы узнаем очень много нового", - говорит Анна Куссенс, иммунолог из Института медицинских исследований в Парквилле, Австралия.
Двойное секвенирование
В легких M. tuberculosis может инфицировать два вида иммунных клеток: альвеолярные макрофаги, которые живут там, и интерстициальные макрофаги, которые привлекаются из кровотока. Рассел и его коллеги хотели понять, как эти различные типы клеток борются с бактерией, и как они будут реагировать в свою очередь. Чтобы выяснить это, они решили собрать сиквенсы РНК как из отдельных клеток хозяина, так и из бактерии в живых животных. По словам Рассела, никто раньше не проводил такого рода секвенирование при инфекциях in vivo.
Во-первых, команде требовался способ определить, как микробы ведут себя в клетках хозяина. В частности, исследователям нужен был ген, который бактерии могли бы включать, когда боролись за выживание. После многолетних испытаний они выбрали регуляторный элемент из гена стресс-реакции hspx. Они соединили его с геном зеленого флуоресцентного белка, чтобы патогены, подвергшиеся стрессу, светились зеленым цветом. Второй, постоянно включенный красный флуоресцентный белок служил в качестве контроля. Исследователи заразили мышей этим двухцветным репортерным штаммом. Через три недели они гомогенизировали ткани легких и отсортировали клетки на те, в которых находились красные бактерии, и те, в которых находились красно-зеленые бактерии.
Следующим шагом было выделение и секвенирование РНК клеток-хозяев и патогенов. Это было далеко не тривиально, говорит Рассел. Чтобы избежать контаминации РНК хозяина бактериальным материалом и наоборот, им пришлось выделять РНК поэтапно. Сначала они использовали химический раствор под названием Trizol, чтобы вскрыть клетки хозяина. После выделения эукариотической РНК они использовали специальную технологию, чтобы вскрыть M. tuberculosis и выделить его РНК.
Закономерности стресса
Полученные сиквенсы выявили четкие закономерности в том, как хозяин и патоген реагировали друг на друга. Макрофаги, которые эффективно защищались, на что указывало наличие сиквенсов РНК защитных генов, удерживали больше бактерий, подвергшихся стрессу, чем те, которые не смогли справиться с патогенами. Рассел был удивлен тем, что транскриптомы хозяина и патогена так хорошо совпадают. В целом, интерстициальные макрофаги были более успешны в борьбе с бактериальной инфекцией, чем альвеолярные макрофаги; например, они вырабатывали белок, который производит оксид азота для атаки захватчиков. Однако часть альвеолярных макрофагов также реагировала подобным образом.
Такая информация может оказаться полезной для разработчиков вакцин, говорит Рассел. Хотя существует вакцина против туберкулеза, она не эффективна у взрослых. Разработчики вакцин могли бы решить эту проблему, полагает он, дополнив свои препараты, чтобы стимулировать эффективный ответ макрофагов. В исследовании также приводится длинный список генов хозяина, который должен указать исследователям пути, способствующие или препятствующие выживанию бактерий.
Двойная визуализация
Сандер ван Кастерен, химический биолог из Лейденского университета в Нидерландах, называет исследование Рассела выдающимся. "Такой уровень детализации просто поразителен", - говорит он.
Сотрудники его лаборатории также изучают M. tuberculosis и Salmonella enterica на уровне отдельных клеток хозяина, хотя и в культуре, а не in vivo. Они используют двойной подход к визуализации, называемый корреляционной светоэлектронной микроскопией (CLEM): он начинается с флуоресцентной микроскопии для просмотра специфических флуоресцентных маркеров, а затем использует электронную микроскопию для визуализации субклеточной структуры клеток хозяина.
Чтобы присоединить флуоресцентные маркеры к соответствующим молекулам, команда использовала технику, называемую химией щелчка (click chemistry). Классическая реакция щелчка соединяет богатую азотом азидную группу с углеродной группой с тройной связью, называемой алкином, в присутствии меди. Исследователи предоставили M. tuberculosis азидсодержащий аналог аминокислоты метионин и алкинсодержащую версию аминокислоты аланин, которая используется только в клеточных стенках бактерий.
После заражения и фиксации клеток хозяина они добавляли зеленый флуорохром, содержащий алкин, который присоединялся к аналогу метионина для маркировки бактериальных белков, и красный флуорохром с азидом для визуализации клеточных стенок бактерий. Полученные изображения, собранные с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, показали, где именно в клетках находятся бактерии, и сбросили ли они свои защитные клеточные оболочки. Обычно на этом эксперимент по микроскопии заканчивался. Но для сотрудника лаборатории Томаса Баккума это был только первый шаг.
Баккум взял те же слайды и использовал трансмиссионную электронную микроскопию для визуализации клеток в наномасштабе. Накладывая друг на друга световые и электронные изображения в виде огромных фотографий - их площадь составила бы 144 квадратных метра, если бы он распечатал их, - Баккум смог увидеть форму бактерий и любые клеточные органеллы, с которыми они связаны, в мельчайших деталях. Он обнаружил, что погибшие микробы, как правило, скапливаются в вакуолях, тогда как живые микробы обычно находятся в цитозоле.
По мнению Баккума, наиболее логичным применением этой техники было бы испытание новых антибиотиков на культивируемых клетках. CLEM позволит исследователям точно определить, как препараты влияют на место скопления бактерий и теряют ли они свои клеточные стенки. В качестве эксперимента он испытал на своих культурах несколько противотуберкулезных антибиотиков.
Как и Рассел, Баккум и его коллеги увидели, что бактериальные клетки не всегда одинаково реагируют на, казалось бы, одинаковые клеточные условия. Даже внутри клетки некоторые бактерии погибали; некоторые не менялись; другие принимали причудливую, угловатую форму, говорит ван Кастерен. Некоторые из этих разнообразных реакций на лечение могут помочь бактериям выжить, предполагает он.
Резервуары для препаратов
Максимилиано Гутьеррес, клеточный биолог из Института Фрэнсиса Крика в Лондоне, также использовал CLEM для изучения эффективности антибиотиков, но с аналитико-химическим уклоном. В исследовании, опубликованном в 2019 году, Гутьеррес хотел локализовать атомы брома в антибиотике бедаквилин, используемом для лечения лекарственно-резистентного туберкулеза, чтобы увидеть, куда переходит препарат. После световой и электронной микроскопии его группа подвергла образцы масс-спектрометрии под названием ионная микроскопия, которая собирает данные о молекулярном весе и локализации.
Анализ показал, что бедаквилин имеет тенденцию накапливаться в липидных каплях в клетке хозяина. Эти капельки служили своего рода резервуаром для антибиотика, поскольку бактерии добывали в них энергию и в процессе получали лекарство. Хотя фармацевтические компании обычно стараются избегать жирорастворимых лекарств, поскольку они недолго сохраняются в организме, Гутьеррес говорит, что его исследование показывает, что они не должны быть столь нерешительными, чтобы рассмотреть возможность использования таких соединений для лечения туберкулеза.
Гутьеррес говорит, что подход, основанный на тройной визуализации, сыграл решающую роль в их открытии. Это "единственный способ визуализировать, куда попадают препараты", - говорит он. И подобные мультимодальные исследования могут стать будущим исследований хозяина-патогена, добавляет ван Кастерен. Но, по его словам, исследователи могут пойти еще дальше - возможно, объединив свой подход к маркировке с помощью химии кликов для идентификации интересующих клеток с методом двойного секвенирования Рассела для выявления ответных реакций.
Спустя 9 000 лет такие комбинации могут дать ученым мощное преимущество в борьбе с болезнью.
