Система комплемента человека играет ключевую роль в первых линиях защиты от вторжения бактерий.
Она является частью врожденной иммунной системы и состоит из семейства растворимых белков, которые образуют защитный каскад в крови и других жидкостях организма. Хотя активация комплемента может быть вызвана врожденным распознаванием, этот процесс гораздо эффективнее в присутствии специфических антител. Антитела могут связываться с бактериями с помощью своих фрагментов, связывающих антиген (Fab), и взаимодействовать с иммунной системой с помощью своего кристаллизующегося фрагмента (Fc).
Антителозависимая активация комплемента начинается, когда компонент С1 связывается с комплексами антиген-антитело на поверхности бактерий. В оптимальном случае шесть связанных с поверхностью мономеров IgG могут объединяться через Fc-Fc-взаимодействия, образуя гексамер. Этот гексамер служит платформой, к которой C1 может присоединиться через свои шесть Fc-связывающих доменов, что приводит к активации C1 и началу реакции комплемента. Активация комплемента в отношении бактерий приводит к осаждению опсонина C3b и высвобождению анафилатоксина C5a, которые способствуют фагоцитарному поглощению и уничтожению бактерий фагоцитами человека.
Кроме того, активация комплемента вызывает образование летальных пор мембранного атакующего комплекса (MAC) во внешней мембране грамотрицательных бактерий. Хотя антибактериальные антитела могут вызывать активацию комплемента, остается малопонятным, почему одни антитела активируют комплемент, а другие - нет. Хотя связывание антител с поверхностью бактерий является необходимым условием, неизвестно, какие структуры бактериальной поверхности являются хорошими мишенями для эффективного ответа комплемента. Такие базовые представления об эффективной активации комплемента антибактериальными антителами важны для разработки терапии на основе антител против проблемных инфекций.
Klebsiella pneumoniae - важный оппортунистический патоген человека, часто вызывающий внутрибольничные инфекции. Большую озабоченность вызывает значительный рост антибиотикорезистентности, наблюдаемый среди клинических изолятов K. pneumoniae, что затрудняет лечение инфекций. Только в 2019 году K. pneumoniae стала причиной более 700 000 смертей в мире, связанных с антибиотикорезистентностью, что делает ее третьей ведущей причиной смертей, связанных с антибиотикорезистентностью.
Как и у всех грамотрицательных бактерий, внешняя мембрана K. pneumoniae состоит в основном из липополисахаридов (ЛПС). ЛПС состоит из закрепленного на мембране липида А, соединенного с основным олигосахаридным участком, который декорирован полисахаридной цепочкой О-антигена, состоящей из повторяющихся сахарных молекул. О-антиген может защищать K. pneumoniae от системы комплемента, препятствуя распознаванию поверхностных структур, а также препятствуя правильному формированию MAC.
K. pneumoniae может экспрессировать различные типы О-антигенов, которые отличаются по молекулярному составу. С клинической точки зрения наиболее актуальными являются О1, О2 и О3 О-типы, так как они составляют 80% клинических изолятов. Кроме того, большинство антибиотикорезистентных и гипервирулентных штаммов экспрессируют O1- или O2-антигены. Другой важной и весьма разнообразной структурой поверхности K. pneumoniae является полисахаридная капсула. Капсула играет важную роль во время инфекции K. pneumoniae, поскольку она защищает от распознавания антителами, системы комплемента и фагоцитоза.
Описано более 70 различных типов капсул, экспрессируемых K. pneumoniae, и еще больше типов было предсказано на основе генетического разнообразия капсульного локуса. Улучшенное понимание опосредованной антителами активации комплемента на K. pneumoniae имеет решающее значение для разработки антителотерапии. K. pneumoniae в первую очередь инфицирует людей с ослабленной иммунной системой, таких как новорожденные, пожилые и иммунокомпрометированные пациенты. Хотя их адаптивный иммунный ответ скомпрометирован, у этих пациентов часто сохраняется функционирующая система комплемента. Это означает, что разработка антител, повышающих функции комплемента, предоставляет уникальную возможность усилить клиренс бактерий под действием системы комплемента пациента. Однако до сих пор неясно, какие бактериальные антигены должны быть направлены для создания эффективного ответа комплемента на K. pneumoniae.
В настоящее время В-клетки памяти являются предпочтительным источником для поиска антител, поскольку они экспрессируют мембраносвязанные антитела в качестве В-клеточных рецепторов (BCR) на своей поверхности. Секвенирование BCR зависит от выделения антиген-специфических В-клеток с использованием очищенных антигенов в качестве приманки для мембранно-связанных BCR. Предыдущие усилия по выявлению человеческих моноклональных антител против бактерий в основном были направлены на антитела, нацеленные на один заранее определенный антиген. В случае K. pneumoniae этот подход был успешным для идентификации высокоаффинных антител против очищенного O-антигена.
Селекция В-клеток с одним антигеном препятствует выявлению антител против других мишеней бактериальной поверхности. Антитела, направленные против разных антигенов, могут по-разному активировать систему комплемента. Получение антител, направленных к разным антигенам одного и того же бактериального штамма, необходимо для изучения различий в активации комплемента, опосредованной антителами. Это также поможет выяснить, может ли смешивание различных моноклональных антител, имитирующее иммунные реакции при естественной инфекции, улучшить поражение бактериальных клеток.
В данной работе мы разработали антиген-диагностический подход для выявления моноклональных антител, распознающих поверхность K. pneumoniae. Поскольку мы не знаем, какие поверхностные антигены вызывают мощную активацию комплемента, мы решили не выбирать определенный антиген, а обработать B-клетки целыми бактериальными клетками, сохраняя бактериальные антигены в их естественном контексте. Используя метод двойного окрашивания с использованием бактерий, меченных с помощью клик-химии, мы успешно идентифицировали 29 уникальных антител против двух клинических штаммов K. pneumoniae. Идентификация мишеней и функциональные исследования показали, что антигенные мишени на поверхности бактерий в значительной степени определяют способность к активации комплемента. Кроме того, анализ смесей антител показал, что некоторые антитела могут действовать синергично, усиливая связывание друг друга с поверхностью в Fc-независимой манере.
В целом, данная работа может способствовать лучшему пониманию опосредованной антителами активации комплемента по отношению к бактериальным клеткам, что ускорит разработку эффективных иммунотерапевтических средств против бактериальных инфекций.
