Патогены ESKAPEE, освобожденные от биопленки под действием таргетного моноклонального препарата, становятся чувствительными к действию традиционных антибиотиков (аннотация)Патогены ESKAPEE, освобожденные от биопленки под действием таргетного моноклонального препарата, становятся чувствительными к действию традиционных антибиотиков
Резистентность бактерий к противомикробным препаратам (AMR) представляет собой глобальную проблему такого масштаба, что ее называют "тихой" пандемией из-за относительно ограниченного внимания к ней.
Многогранные причины роста числа AMR можно объяснить несколькими факторами, включая социальные (индустриализация и плотность населения), генетические (мутации, горизонтальный перенос генов (ГПГ) и селективное давление), экологические (использование антибиотиков в сельском хозяйстве и неправильная утилизация антибиотиков), а также чрезмерное и неправильное использование антибиотиков (доступ без рецептов, применение после окончания назначенного срока лечения и избыточное назначение).
Основной вклад в развитие AMR вносят наши усилия по лечению заболеваний, особенно в тех случаях, когда биопленки играют значительную роль в патогенезе, рецидивах и хроническом течении, причем антибиотики являются единственным выходом, поскольку других вариантов в настоящее время не существует. В то время как бактериальный возбудитель обычно обладает высокой чувствительностью при планктонном выращивании в богатой среде, как это делается в лаборатории клинической микробиологии, в очаге инфекции бактерии обычно обитают в биопленке, что в значительной степени способствует возникновению резистентности к рекомендованной антибиотикотерапии.
Биопленки - это трехмерные сообщества бактерий, образующиеся на поверхностях (биотических или абиотических); они также могут существовать в несвязанном агрегатном состоянии (например, биопленки, обитающие в легких и/или мокроте). Бактерии, обитающие в биопленках, заключены в самовоспроизводящуюся внеклеточную полимерную субстанцию (ВПС), состоящую из экзополисахаридов, белков, липидов и, как правило, внеклеточной ДНК (эДНК) и т.д..
Такой предпочтительный образ жизни бактерий способствует развитию различных механизмов толерантности к антибиотикам и иммунным эффекторам, которые включают поддержание метаболизма в состоянии покоя, использование кворумного зондирования и выработку ВПС, ограничивающей доступ антибиотиков и иммунных эффекторов. Кроме того, мишени специфических антибиотиков, такие как клеточная стенка и/или синтез белка, часто не подвергаются активной экспрессии бактериями, находящимися в состоянии покоя. Аналогичным образом, кворум-сенсинг может приводить к повышению уровня регуляции генов, продукты которых способствуют резистентности, например, эффлюксных насосов, выводящих антибиотики из клетки. Таким образом, для уничтожения бактерий, обитающих в биопленке, требуется увеличение концентрации антибиотика в 1000 раз по сравнению с их планктонными, или свободноживущими, аналогами.
Невосприимчивость бактерий в биопленках к антибиотикам и иммунным эффекторам вызывает огромную озабоченность, поскольку до 80% бактериальных инфекций человека имеют биопленочный компонент. Кроме того, неподатливость биопленок способствует длительному выживанию бактерий на абиотических поверхностях, в том числе на медицинских изделиях, как это происходит в клинических условиях; это может служить питательной средой для ГПГ и способствовать дальнейшему распространению AMR.
Несмотря на активные усилия, ни одна стратегия или средство не доказали своей полной эффективности в эффективном лечении или, в идеале, в предотвращении рецидивирующих биопленочных заболеваний. Поэтому лечение традиционными антибиотиками по-прежнему является стандартом медицинской помощи, несмотря на повсеместную недостаточную клиническую эффективность. Одной из потенциальных стратегий преодоления этих препятствий является разработка широко эффективной и, в идеале, видоспецифичной методики разрушения биопленок и высвобождения бактерий-резидентов, чтобы их можно было уничтожить традиционными антибиотиками, которые были неэффективны, когда эти патогены находились внутри биопленки.
Такой подход в целом представляется перспективным, поскольку в ряде лабораторий было показано, что бактерии, недавно освобожденные из биопленки, независимо от конкретного способа освобождения, демонстрируют переходный фенотип значительно повышенной чувствительности к антибиотикам. Мы также продемонстрировали, что если разрушить биопленку, сформированную минимально пассированными нетипируемыми Haemophilus influenzae (NTHI), доминирующим патогеном респираторного тракта, с использованием антител, направленных на широко распространенный структурный белок матрикса биопленки - вновь освобожденные (или NRel) бактерии NTHI проявляют значительную чувствительность к киллингу in vitro триметопримом/сульфаметоксазолом, амоксициллином, ампициллином или цефдиниром. Эти же антибиотики не смогли уничтожить изолят NTHI, когда он находился в биопленке.
Антитела, которые мы использовали для разрушения биопленки, нацелены на важнейший структурный компонент биопленки - два бактериальных ДНК-связывающих белка, известных как семейство DNABII. Внеклеточно белки DNABII [гистоноподобный белок (HU) и фактор интеграция-хозяин (IHF)] связываются с двухцепочечными ДНК и сгибают их внутри ВПС биопленки; таким образом, они обеспечивают необходимую поддержку матрикса биопленки. Инкубация биопленок с антителами, нацеленными на DNABII, не убивает резидентные бактерии, а вызывает равновесный сдвиг белков DNABII из связанного с эДНК состояния в матриксе биопленки в несвязанное состояние во внеклеточной среде, что приводит к быстрому разрушению биопленки и освобождению NRel.
К настоящему времени на основании подсчета количества колоний на чашках и анализа изображений мы продемонстрировали, что использование этих антител в однократной дозе и времени инкубации эффективно разрушает биопленки, образованные 23 родами бактерий in vitro, в диапазоне от 57 до 91%. Мы также продемонстрировали эффективную очистку от бактерий и матрикса биопленки in vivo на трех различных доклинических моделях заболеваний человека, в которых не использовались дополнительные антибиотики.
В недавнем исследовании мы продемонстрировали, что NRel, индуцированные инкубацией биопленок, образованных шестью распространенными патогенами респираторного тракта, с гуманизированным моноклональным антителом, нацеленным на DNABII, были сенсибилизированы к уничтожению антибиотиками. В данном исследовании мы сосредоточили свои усилия на семи высоковирулентных, образующих биопленки патогенах ESKAPEE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp, и Escherichia coli), которые часто обладают множественной лекарственной резистентностью (MDR) и, таким образом, обычно "уходят" от антибиотикотерапии.
ВОЗ считает патогены ESKAPEE "критическими" и "высокоприоритетными", против которых должна быть направлена разработка новых терапевтических стратегий. Эти патогены ответственны за большинство инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (HCAI), и особенно опасны при имплантации внутривенных медицинских устройств. В 2011 году патогены ESKAPEE были ответственны почти за половину всех HCAI в США, а в 2019 году они стали причиной почти 70% смертей, связанных или объясняемых AMR, а также ~10% всех смертей в мире.
В последних публикациях мы показали, что в зависимости от возраста биопленки и относительной концентрации и/или продолжительности обработки анти-DNABII антисыворотками биопленки, сформированные каждым из патогенов ESKAPEE, могут быть разрушены на 37-100%. В данной работе мы изучали, может ли обработка биопленок ESKAPEE гуманизированными моноклональными антителами, мишенью которых являются защитные эпитопы белка DNABII (например, "HuTipMab"), индуцировать формирование NRel, столь же высокоуязвимых для антибиотико-опосредованного киллинга.
Методы: В данной работе мы использовали гуманизированные моноклональные антитела (HuTipMab), направленные против защитных эпитопов белка DNABII, для определения возможности разрушения биопленок, образованных высокоприоритетными патогенами ESKAPEE, что было визуализировано с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и анализа COMSTAT2. Затем мы продемонстрировали потенцирование киллинга индуцированных NRel семью различными классами традиционных антибиотиков путем сравнительного подсчета колоний на чашках.
Результаты: При однократном применении HuTipMab биопленки ESKAPEE разрушались на 50%-79% при однократном тестировании дозы и периода лечения. NRel каждой биопленки были значительно более чувствительны к киллингу, чем их планктонные аналоги (до сих пор считавшиеся наиболее чувствительными к киллингу, опосредованному антибиотиками), даже при тестировании в долях МИК (1/250-1/2 МИК). Более того, бактерии, оставшиеся в биопленках двух репрезентативных ESKAPEE-патогенов после разрушения HuTipMab, также были значительно более чувствительны к уничтожению антибиотиками.
Выводы: Новые данные, представленные в этом исследовании, поддерживают нашу дальнейшую разработку комбинированой терапии, при которой HuTipMab доставляется пациенту с рецидивирующим заболеванием, вызванным патогенами ESKAPEE, для разрушения патогенных биопленок, а также совместно с дозой антибиотика, способность которого быстро убивать индуцированные NRel была продемонстрирована. Эта новая схема может обеспечить более успешный клинический исход для пациентов с хроническими, рецидивирующими или рецидивирующими заболеваниями, ограничивая при этом дальнейшее распространение AMR.
