Парадигма оценки эффективности антибиотиков основана на анализах in vitro, которые не учитывают взаимодействие хозяин-патоген, способное оказать заметное влияние на эффективность препарата.
Основной анализ in vitro для оценки антибиотиков, разработанный в 1940-х годах, использует богатую питательными веществами бактериологическую среду - бульон Мюллера-Хинтона (MHB). Этот метод используется во всем мире для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (AST) для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), стандартного измерения активности антибиотика.
МИК определяет клинический брейкпойнт - концентрацию антибиотика, используемую для определения того, может ли инфекция, вызванная данным клиническим изолятом поддаваться лечению у пациента. Клинические брейкпойнты используются клиническими микробиологическими лабораториями для определения изолятов пациентов как чувствительных (S) или устойчивых (R) к группе антибиотиков. Таким образом, биопроба на MHB in vitro уже более полувека является критериальным стандартом для руководства лечебной практикой врачей, отслеживания вспышек и эпидемий, а также оценки химических соединений при разработке новых терапевтических средств.
Несмотря на эти успехи, биопробы in vitro в корне несовершенны, поскольку эффективность антибиотиков сильно зависит от контекста, на нее влияет:
- состав среды (pH, буферы, осмолярность, питательные вещества);
- факторы патогена (нагрузка, вирулентность, гены резистентности);
- факторы хозяина, которые могут действовать синергично с антимикробными препаратами (антимикробные пептиды, комплемент, нейтрофилы);
- и образование реактивных побочных продуктов метаболизма после воздействия антибиотиков.
Таким образом, терапия AMR часто зависит от клинического обоснования врачами в каждом конкретном случае при поддержке организаций, предоставляющих современные рекомендации по клиническому лечению.
Были достигнуты значительные успехи в повышении точности, с которой анализы in vitro предсказывают клинический результат. Об этом свидетельствует:
(1) оценка антибактериальной активности с использованием сыворотки крови пациентов,
(2) использование сред, имитирующих хозяина, для повышения точности прогноза, и
(3) синергия антибиотиков с катионными антимикробными пептидами и реактивными побочными продуктами метаболизма, с последующим переходом к терапии первой линии.
Однако остаются значительные препятствия, поскольку многие из этих методик требуют либо образцов пациентов, либо моделирования тканей хозяина, либо добавления очищенных биологических веществ, либо использования бактериальных метаболических систем.
В данном исследовании мы сообщаем о разработке альтернативного протокола AST для широкого клинического применения на основе сред, более физиологически репрезентативных для условий инфекции in vivo (среда культуры клеток млекопитающих, сыворотка человеческого донора или моча) по сравнению со стандартной бактериологической средой MHB.
MHB поддерживает рост бактерий и не предназначена для имитации какого-либо аспекта окружающей среды хозяина. Напротив, среда для клеточных культур поддерживает рост клеток млекопитающих, отражая физиологические условия, более соответствующие местам микробной инфекции in vivo, а человеческие сыворотки или моча часто являются местом/путем распространения бактерий.
Были оценены МИК клинически значимых антибиотиков против ESKAPE (Enterococcus faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa и Enterobacter spp.) патогенов (которые избегают биоцидного действия антибиотиков) в физиологических средах, а диагностическая точность оценивалась в мышиных моделях сепсиса. Используя одобренные FDA антибиотики, мы обнаружили, что AST в среде культуры клеток млекопитающих повышает точность диагностики, тем самым обосновывая клиническое использование существующих антибиотиков для потенциального лечения AMR-инфекций.
Наши результаты показывают, что переоценка существующих антибиотиков, может стать важным дополнением к разработке новых препаратов для борьбы с резистентностью к противомикробным препаратам. При сравнении физиологических сред (клеточной культуральной среды DMEM, сыворотки, мочи) со стандартной бактериологической средой MHB ∼15% значений МИК, полученных в физиологических средах, предсказывали изменение чувствительности, которое пересекало клинический брейкпойнт - концентрацию антибиотика, используемую для определения того, может ли инфекция с данным клиническим изолятом поддаваться лечению у пациента.
Диагностическая точность этих дискордантных МИК увеличилась, когда тестирование проводилось в клеточной культуральной среде DMEM и анализировалось на мышиных моделях грамположительного и грамотрицательного сепсиса. Усовершенствование теста отражало как улучшенное прогнозирование успеха антибиотикотерапии, так и тенденцию к улучшению прогнозирования неудачи антибиотикотерапии. Это позволило выявить потенциально эффективные антибиотики для лечения AMR-инфекций, которые стандартное тестирование не смогло выявить, а также исключить те, которые оказались неэффективными, несмотря на показания к применению на основе стандартного тестирования.
Кроме того, диагностическая точность бактериологической среды увеличивалась, когда результаты теста совпадали с результатами клеточной культуральной среды, но снижалась, когда расходились. Таким образом, согласованность результатов теста между двумя культуральными средами может повысить уверенность при принятии клинических решений, в то время как противоположные прогнозы могут свидетельствовать в пользу вспомогательной терапии по сравнению с основным лечением.
Данное исследование предлагает потенциальное решение для устранения расхождений между результатами применения антибиотиков, показанными стандартной AST, и реальными клиническими результатами. Действительно, ограничения стандартных методов AST для прогнозирования клинической эффективности признаются все чаще, поскольку некоторые антибиотики, отклоненные стандартным тестированием, эффективны при лечении AMR-инфекций.
Об этом свидетельствуют β-лактамы в качестве дополнительной терапии при рефрактерной бактериемии, вызванной MRSA и ванкомицин-резистентным энтерококком, монотерапия азитромицином при мультирезистентной P. aeruginosa, и комбинированная терапия азитромицином/пиперациллин-тазобактамом при CRE Achromobacter xylosoxidans. Кроме того, несмотря на ограниченное применение азитромицина в отношении энтеробактерий (S. Typhi и Shigella spp.), азитромицин используется в клинической практике для лечения диареегенных кишечных палочек, Shigella spp., Salmonella spp, и Campylobacter spp.. Это привело к тому, что были предложены брейкпоинты азитромицина для диареагенной E. coli, и азитромицин рассматривается в качестве стандартной терапии для специфических инфекций Enterobacterales.
Механизм, с помощью которого среда для культивирования клеток DMEM повысила точность прогнозирования эффективности МИК в естественных условиях, по-видимому, основан на присутствии физиологического уровня бикарбоната натрия, анионного буфера, который играет роль в поддержании рН крови и тканей.
Однако роль бикарбоната в чувствительности к антибиотикам не является простым отражением стабилизации рН, поскольку удаление NaHCO3 из экзогенно забуференной среды DMEM привело к МИК, сходным с MHB у многих видов, и, наоборот, добавление NaHCO3 в экзогенно забуференную среду MHB привело к МИК, сходным со средой DMEM. Скорее, бикарбонат является плейотропным ионным фактором, который:
(1) стимулирует глобальные изменения в экспрессии бактериальных генов с последующими изменениями в проницаемости бактериальных мембран, что влияет на чувствительность к катионным пептидам,
(2) влияет на экспрессию генов вирулентности бактерий и их чувствительность к β-лактамным антибиотикам, и
(3) способствует рассеиванию бактериальной протонной движущей силы, необходимой для активности или импорта/экспорта различных классов антибиотиков и некоторых иммунных компонентов (дефенсинов, кателицидинов, желчных солей).
Кроме того, такие изменения чувствительности к антибиотикам могут оказывать косвенное влияние на бактерицидное действие через стимуляцию цитокиновых реакций хозяина, важных для уничтожения бактерий. Например, опосредованные бикарбонатом изменения в проницаемости бактериальных мембран могут повышать уровень β-лактамов. β-лактамы могут увеличить экспрессию α-токсина S. aureus, что, в свою очередь, может вызвать иммуностимулирующий ответ интерлейкина-1-β (IL-1-β) с последующим усилением распознавания и очищения организма от бактерий для успешного лечения бактериемии S. aureus.
Тестирование в каждой из трех исследованных физиологических сред (DMEM, человеческая сыворотка или моча) привело к одинаковой доле МИК (∼15%), которые предсказывали изменение клинической классификации брейкпоинтов. Повышение диагностической точности DMEM по сравнению с другими протестированными физиологическими средами не обусловлено исключительно наличием бикарбоната, поскольку он также присутствует в сыворотке и моче человека (DMEM∼ 44 мМ; сыворотка ∼25 мМ; моча ∼2,5 мМ).
Однако это может отражать то, что DMEM поддерживает рост клеток млекопитающих, имитируя физиологические условия, более соответствующие местам микробной инфекции in vivo. Другая возможность заключается в том, что результаты, касающиеся предсказательной силы сыворотки или мочи человека (по сравнению с DMEM или MHB), не применимы к мышам, но могут быть применимы к человеку из-за присущих этим двум видам различий в среде, которые влияют на потенцию лекарств.
Примечательно, что результаты, полученные на животных моделях системной инфекции, не всегда можно легко перенести на другие виды инфекций, включая респираторные, кожные, инфекции мочевыводящих путей (ИМП) или даже некоторые случаи бактериемии (учитывая путь заражения используемых моделей), и поэтому отдельные физиологические среды могут быть более предсказуемыми для соответствующего участка инфекции. Поэтому выводы относительно прогностической силы сыворотки или мочи (по сравнению с DMEM или MHB) требуют дальнейшего изучения с использованием дополнительных моделей инфекции (например, респираторной, кожной, ИМП).
Применение метода AST в физиологических средах может повлиять на способы тестирования, разработки и назначения антибиотиков и имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами. Прежде всего, это повышенная точность диагностики. Дополнительные преимущества включают поддержку роста большинства патогенов, наблюдаемых в клинической практике, и легкость внедрения в существующие протоколы/инструментарий, что делает методологический переход к другим условиям культивирования простым, масштабируемым и доступным.
Усовершенствованные методы AST потенциально полезны как для эмпирической антимикробной терапии (до получения культуры крови и результатов AST), так и для окончательной антимикробной терапии (после получения культуры крови и результатов AST), что в конечном итоге может улучшить клиническое ведение и исход пациентов. Тестирование в физиологической среде клеток млекопитающих, примером которой является DMEM, обеспечивает платформу для оценки как одобренных антибиотиков, так и других соединений, находящихся в стадии разработки, что потенциально может привести к значительной экономии средств и спасению жизней.
