Пионер мультиплексного редактирования
Джордж Черч снова в деле, на этот раз он использует мультиплексное редактирование генов для создания клеток, защищенных от вирусов, повышения успешности трансплантации органов и защиты слонов.
В кампусе Лонгвуд Гарвардского университета генетик Джордж Черч занимается синтетической биологией. Если он не руководит своими студентами в создании новейших биотехнологических прототипов, то совместно со своими бывшими коллегами занимается новыми деловыми предприятиями. Черч известен как первопроходец в мире биоинженерии. В некоторых дисциплинах он наиболее известен благодаря своей работе по прямому секвенированию генома и проекту "Геном человека". В других областях он и его студенты оказались в центре внимания, доказав возможности редактирования CRISPR-Cas9 человеческих клеток. Но проекты, над которыми сейчас трудится его команда, могут оказать самое большое влияние на научное сообщество в целом.
"Наша лаборатория находится в экстремальной точке кривой, и мы убедились, что в большинстве случаев, когда мы находились в этой точке, проходило всего пару лет, прежде чем нас настигало цунами возможностей", - рассказывает Черч. Эта конкретная крайняя точка - мультиплексное редактирование генома. Сегодня в его лаборатории существует несколько уникальных вариантов использования мультиплексного редактирования генома, на которые обращают внимание биологи, занимающиеся синтетической биологией.
Инструментарий мультиплексного редактирования
За последние несколько десятилетий редактирование генов превратилось из жанра научной фантастики в важнейшую часть реальности. Этот прогресс во многом обусловлен оттачиванием технологий на основе CRISPR, а также другими передовыми инновациями. Родольф Баррангоу, руководитель лаборатории CRISPR в Университете штата Северная Каролина, был одним из первых, кто обнаружил начальные повторяющиеся участки CRISPR в геноме Streptococcus thermophilus. Его группа поняла, что фермент Cas9 приводит к формированию адаптивного иммунитета; они показали, как бактерии хранят, распознают и обмениваются информацией о вирусных патогенах. CRISPR начинался как естественный способ скрининга бактерий, устойчивых к бактериофагам, рассказал Баррангоу.
То, что Баррангоу и другие открыли для себя из этих небольших начинаний, привело к появлению множества новых возможностей для редактирования CRISPR, которое часто описывается как фермент Cas9, управляемый РНК, который совместно отрезает часть ДНК для удаления или вставки новой информации. Сегодня CRISPR способен на гораздо большее, включая активацию или репрессию гена с помощью деактивированной формы белка Cas - для этого не нужно ничего вырезать. Среди других достижений - редактирование оснований, при котором редактируется по одному основанию за раз с помощью белков Cas, делающих небольшую зарубку в одной нити ДНК.
Однако при редактировании генов все еще остается большая проблема, которая заключается в том, что ученые могут вносить лишь отдельные правки то тут, то там. Многие заболевания являются полигенными по своей природе. А сложные проблемы, связанные с изменением климата и промышленной биоинженерией, не могут быть решены одним быстрым редактированием или регулированием одного-двух генов в организме. В течение десятилетий продолжались поиски метода редактирования нескольких генов или набора инструментов, которые могли бы справиться со сложными полигенными изменениями.
Когда CRISPR стал предпочтительным инструментом редактирования генов, Черч и его студенты уже приступили к работе над тем, как расширить масштабы этого и других новых биотехнологических инструментов. При мультиплексном редактировании целью является одновременное изменение более чем одного участка генома. Предварительные исследования по разработке методов редактирования десятков, сотен и даже тысяч оснований относятся к этой области мультиплексного редактирования, но Черч обнаружил, что самым большим препятствием для редактирования нескольких генов является не эффективность, а безопасность. "Совсем другое дело - точно отредактировать уникальные последовательности и убедиться, что вы не сделаете ничего серьезно нецелевого", - отмечает Черч.
К внецелевым эффектам относятся неправильная фенотипическая экспрессия соседних генов, которые не были изменены, или масштабная дисфункция генома после многочисленных правок. Например, как бы ни была полезна и эффективна технология CRISPR для редактирования любых генов - от бактерий до человека, многократное использование ее функции расщепления генома может быть токсичным для организма, особенно при использовании терапевтических средств.
В 2009 году Черч и несколько его бывших студентов разработали систему под названием мультиплексная автоматизированная геномная инженерия, или MAGE, которая делает множество правок без двухцепочечных разрывов, которые могут привести к плохим результатам CRISPR. MAGE позволяет выращивать различные популяции клеток с генетическими правками, сделанными путем гомологичной рекомбинации - того же явления, которое наблюдается при мейозе, когда нуклеотидные последовательности пересекаются между похожими хромосомами или генами. Этот метод редактирования иногда называют "рекомбинацией", а биоинспирированный инструмент, используемый в системах MAGE на ранних стадиях, происходит от белка фага лямбда под названием Redβ, более известного как белок однонитевого отжига, SSAP.
Хотя система CRISPR способна редактировать гены многих различных организмов, некоторые методы генной инженерии зависят от вида. В течение десятилетий SSAP использовались только для изменения бактерий, таких как Escherichia coli. SSAP был найден в фаге, который легко инфицирует E. coli и встраивает свои собственные гены в геном, используя связывающие белки хозяина. Для редактирования SSAP присоединяется к олигонуклеотиду, содержащему редактируемые гены. Эта нить ДНК синхронизируется с гомологичным местом в размотанной ДНК, и SSAP связывает нити вместе, начиная с отстающей нити. Этот процесс прост и аналогичен фрагментам Оказаки, наблюдаемым при репликации ДНК. (Фрагменты Оказаки — относительно короткие фрагменты ДНК (с РНК-праймером на 5'-конце), которые образуются на отстающей цепи в процессе репликации ДНК. Длина фрагментов Оказаки у E. coli составляет около 1000—2000 нуклеотидов, а у эукариот — обычно 100—200 нуклеотидов - прим.пер.).
Как составляющая системы MAGE, этот процесс повторяется многократно с помощью множества введений генетически отредактированных олигонуклеотидов, которые соответствуют различным частям генома кишечной палочки. Затем специалист вносит эти изменения в колонию бактерий, где каждый микроб может принять эти изменения и поделиться ими. Черч утверждает, что один исследователь может облегчить создание четырех миллиардов разнообразных модифицированных клеток за день, используя MAGE на десятках участков.
"SSAPs потенциально мощнее, чем CRISPR, с точки зрения их мультиплексной природы и эффективности", - считает Чарльз Белл, структурный биолог из Медицинского колледжа Университета штата Огайо. "Если мы сможем однажды создать что-то, что будет работать на людях, я думаю, что MAGE в некотором смысле может быть еще более мощным".
Белл, который в прошлом сотрудничал с Черчем, тесно работает с SSAPs и использует такие методы, как криогенная электронная микроскопия, для выяснения структуры этих белков. В недавнем исследовании его команда обнаружила белок, гомологичный структуре лямбда Redβ в другом фаге, который также удивительно похож на белок, обнаруженный у человека под названием RAD52. Белок RAD52 является частью человеческого механизма восстановления ДНК и связывается с одиночными нитями ДНК для отжига комплементарных нитей.
"Мы можем выровнять структуры и показать, что существует общая основная форма, поэтому наши структуры фагового белка могут помочь понять этот единый механизм", - говорит Белл. "Структурная работа укрепила связь между белками фага и человеческим RAD52".
Это открытие может стать следующим шагом в разработке мультиплексных SSAPs. Но до тех пор Черч и другие исследователи сочетают мультиплексирование с проверенными и надежными инструментами. Например, сотрудники Черча показали, что редактирование оснований работает в мультиплексном режиме, редактируя 33 важных гена в стволовых клетках человека. Редактирование CRISPR также может работать в масштабах всего генома - независимо от внецелевых эффектов - для получения соединений, необходимых для разработки лекарственных препаратов, например, для производства антикоагулянта гепарина из клеток млекопитающих вместо его извлечения из свиней. Другие исследования показывают, что SSAPs могут помочь в работе системы CRISPR по устранению двунитевых разрывов и уменьшить нежелательные эффекты, потенциально улучшая редактирование одного и нескольких генов.
Баррангоу полагает, что мультиплексное CRISPR-редактирование может быть безопасным и вполне осуществимым для многих приложений, что имеет большие преимущества для биодизайна, позволяя синтетическим биологам совершить следующий скачок в геномном редактировании. Подумайте о "редактировании генома на стероидах"... в эпоху синтетической биологии", - говорит он. Для биоинженерии все больше случаев использования мультиплексов появляются в любопытных местах.
Защита наших микробных фабрик
Команда Черча использовала систему MAGE в различных специальных целях с момента ее разработки. Но использование MAGE для защиты бактерий от вирусов является, пожалуй, одним из самых основополагающих направлений исследований коллектива.
В 2013 году Черч и его студенты внесли небольшие изменения в геном E. coli, чтобы изменить способ доставки трансферной РНК и установки аминокислот в пептидную цепь. Этот первоначальный "перекодированный" штамм с более чем 320 правками мог без проблем синтезировать собственные белки. Но когда в него невольно попадал фаг, он не мог реплицироваться и заразить своего хозяина. Это была первая демонстрация устойчивости к вирусам и даже мобильным генетическим элементам, таким как плазмиды.
В недавнем исследовании под руководством Акоса Ньергеса, синтетического биолога из лаборатории Черча, группа снова изменила генетический код E. coli. Еще более усиленный штамм, названный Ec_Syn61Δ3-SL, не позволяет фагам перехватывать его геномный трансляционный механизм для репликации вирусных белков и имеет дополнительную защиту.
Ньергес просканировал старую версию модифицированного генома E. coli в поисках некоторых кодонов для перекодировки с помощью перепрограммированных тРНК. Два кодона для аминокислоты серин были перестроены для получения вместо нее лейцина. А один стоп-кодон был перепрограммирован для введения аминокислоты, не встречающейся ни в одной живой системе, называемой "нестандартной аминокислотой" или nsAA. Все эти три изменения в геноме сохранили жизненный код Ec_Syn61Δ3-SL стабильным, но при этом неправильно транслировали любой вирус, который попадал внутрь, тем самым останавливая вирусное вторжение.
По сравнению с предыдущей попыткой, предпринятой почти десять лет назад, эта новая модифицированная кишечная палочка продемонстрировала устойчивость ко всем испытанным молекулярным захватчикам, что сделало ее еще более устойчивой к новым вирусам. Команда Ньергеса обнаружила 12 новых штаммов фагов, которые легко заражали предыдущую итерацию модифицированной E. coli, но не новый модифицированный штамм. Ньергес выделил эти фаги повсюду - от сточных вод до речной воды и сельскохозяйственных почв, на которых пасутся животные. " Этот [отбор проб] показал, что вирусный геном содержит множество неизученных функций", - говорит Ньергес. "Эти фаги филогенетически схожи с теми, которые уже были обнаружены при промышленных формах инфицирования, но не характерны для лабораторных организмов. Таким образом, некоторые из родственников этих фагов могут быть проблемой в промышленных ферментациях и лабораторных инфекциях".
Команда в восторге от того, что эта перекодировка создала надежный "брандмауэр" для инфекций, но особенно радует тот факт, что Ec_Syn61Δ3-SL был "биоконсервирован" - не так, как лаборатории и другие учреждения биоконсервируют патогены и другие биологические опасности. Это биоконсервация на молекулярном уровне.
Ньергес говорит, что биоконсервация в их генетически перекодированных клетках выгодна, поскольку они не хотят случайного выхода клеток и распространения измененных генов - даже если это крайне маловероятно. nsAA стал ключевой мерой безопасности на случай, если новый штамм E. coli попадет в дикую природу. "Если вы создадите организм, устойчивый к мультивирусам, то это будет один из немногих лабораторных организмов, который действительно сможет выжить в дикой природе более нескольких минут", - утверждает Черч. "Большинство лабораторных организмов очень хрупкие, очень неконкурентоспособные по сравнению с диким типом, но вы можете представить, что такой организм, достаточно здоровый для использования в производстве и устойчивый ко всем вирусам, будет иметь огромное преимущество во внешнем мире".
Черч любит ссылаться на фильм "Парк Юрского периода" за попытку создания формы биозащиты, но также за неспособность создать точную форму. "Это называлось "непредвиденный случай с лизином", когда динозавры не могли производить аминокислоту лизин. Но она присутствует во всех продуктах питания; вот как мы получаем эту незаменимую аминокислоту", - говорит Черч. Мы хотим использовать подход "Парка Юрского периода", но сделать это правильно".
Черч отметил, что фагу потребовались бы сотни изменений, чтобы преодолеть массовую правку в Ec_Syn61Δ3-SL, так что это настоящая защита. Целью этой лаборатории и других по всему миру будет адаптация этой защиты для устойчивого производства перекодированных микроорганизмов для таких отраслей, как биоремедиация или биотопливо, а также для таких амбициозных начинаний, как изменение генов человека для прямой терапии.
Почему массовое редактирование имеет массовую привлекательность
Защита от вирусов и биосохранение модифицированной E. coli были важной отправной точкой, отмечает Ньергес. "Есть очень широкая сфера применения, либо резистентность, либо MAGE в целом, что будет огромным плюсом для других областей", - добавляет он.
Черч считает, что эта работа очень хорошо переводится в ксенотрансплантацию - еще одно крупное исследование в его лаборатории. В начале 2022 года 57-летний мужчина из Мэриленда получил трансплантат свиного сердца, который продлил его жизнь еще почти на два месяца. Трансплантат был отторгнут не его иммунной системой, что обычно вызывает основное беспокойство. К его смерти привел герпесвирус, встречающийся только у свиней. Черч и его бывший студент Лухан Ян, который сейчас возглавляет биотехнологическую компанию Qihan, основали компанию eGenesis, чтобы взять на себя эти самые риски ксенотрансплантации.
В eGenesis Черч и Янг нацелились на 62 копии порцин-эндогенных ретровирусов (PERV), которые являются вирусными элементами, встроенными в геном свиньи, используя клетки почек. У свиней PERVs безвредны; у людей исследователи не знают, насколько они могут быть патогенны. Черч и Янг исследовали эти элементы и использовали мультиплексную систему CRISPR-Cas9 для инактивации 62 копий вирусных генов, что снизило передачу PERVs из клеток свиньи в клетки человека более чем в тысячу раз. Это доказательство концепции может привести к производству жизнеспособных клеток млекопитающих или трансплантатов для терапевтических препаратов.
Как и PERVs, у человека есть эндогенные ретровирусы и другие повторяющиеся элементы, разбросанные по всему геному. Раньше эти повторяющиеся регионы рассматривались как "ненужная ДНК", но теперь исследования показывают, что они могут нарушать экспрессию генов, инициировать заболевания и влиять на процесс старения. "По сути, мы рассматриваем все категории основных повторов в геноме человека, некоторые из которых насчитывают миллионы повторов", - считает Черч. Его лаборатория дошла до исследования 24 000 повторяющихся элементов, используя мультиплексирование в качестве метода выбора.
Помимо биомедицинского применения, Черч выводит мультиплексную инженерию на новые рубежи, прямо с киноэкрана. С помощью своей компании Colossal его исследователи намерены защитить одних из крупнейших в мире инженеров экосистем - слонов. Так что мир, подобный тому, что был в "Парке Юрского периода", в конце концов, может оказаться не таким уж фантастическим.
Даже если мультиплексная геномная инженерия не произведет такого фурора, как технология CRISPR, Черч, по крайней мере, надеется, что эта новая биотехнология может вызвать такой же прилив вдохновения, какой она вызвала в его собственной лаборатории. "Все, что мы сделали для улучшения мультиплексного редактирования, даже бактериальное мультиплексное редактирование, повлияло на нашу работу над клетками млекопитающих", - говорит Черч. "А все, что мы делаем со стволовыми клетками человека, повлияло на проект со слонами, и это продолжается. Использование мультиплекса дает определенный синергетический эффект между этими областями".
