Обычные тесты, которые охватывают только небольшой участок генетического кода, часто пропускают вариации, скрывающиеся за пределами генома, кодирующего белки.
Эмме Бродбент только исполнился год, когда ее родителям сообщили, что, несмотря на месяцы обследований, врачи до сих пор не могут объяснить ее состояние. В мозге Эммы не развивался миелин - оболочка, защищающая нервные аксоны, - и девочка не соответствовала нормам развития. Было множество проблем с питанием и сном и семья дважды в 2016 году преодолела тысячи миль от своего дома в Техасе до Детской больницы Филадельфии в Пенсильвании. Там исследователи изучили все белково-кодирующие гены в ДНК Эммы - так называемый экзом - и ничего не нашли. Родителям Эммы сказали, что у нее редкое заболевание, но его точная природа скрывается где-то еще в ее геноме.
Несмотря на то, что такие заболевания, как у Эммы, по отдельности являются редкими, в совокупности они довольно распространены и поражают около 5% людей во всем мире. Около 80% редких заболеваний являются генетическими. В поисках генетических вариантов, вызывающих заболевание, врачи регулярно направляют людей на секвенирование заранее определенных наборов генов, называемых панелями, а в последнее время и целых экзомов. Но хотя секвенирование экзомов сократило диагностическую одиссею для некоторых людей и семей, оно по-прежнему оставляет нераскрытыми до 75% случаев.
Это не должно удивлять. Ведь экзомы составляют всего 1,5% генома человека. Остальные 98,5%, возможно, не кодируют белки, но содержат инструкции по превращению каждого гена в мессенджерную РНК, а затем в белок. Изменения в этих частях генома могут вызывать заболевания так же легко, как и в регионах, кодирующих белки. Изучать только экзомы - все равно что искать одну-единственную опечатку во всей библиотеке, ограничиваясь книгами из раздела классики.
На помощь приходит секвенирование всего генома, также называемое полногеномным секвенированием, которое позволяет выявить аномалии как в экзоме, так и в некодирующих частях генома. «Один тест способен заменить собой большинство других тестов, которые разрабатывались и предлагались на протяжении всей истории геномной диагностики», - поясняет Брендан Ли, клинический генетик и исследователь из Медицинского колледжа Бэйлора (США).
Этот метод стал доступен американским врачам с 2018 года. Сначала они редко прибегали к нему, поскольку он был более дорогостоящим и сложным, чем секвенирование экзома или генные панели. «Это была своего рода „последняя попытка“, - говорит Моника Войцик, неонатолог и клинический генетик из Бостонской детской больницы. Но сейчас, когда тест стоит менее 1000 долларов США, а новые методы изучения генома становятся доступными, многие считают, что секвенирование всего генома должно предлагаться гораздо раньше в диагностическом процессе. Сейчас мы говорим: «Давайте начнем с [целого] генома», - говорит Войцик.
За последние пять лет всплеск исследований продемонстрировал, как секвенирование всего генома может дать ответы как отдельным людям, так и целым популяциям. В Соединенных Штатах этот метод используется пока единично и врачи пытаются добиться возмещения расходов на проведение теста со стороны частных и государственных медицинских страховых компаний. В Великобритании и некоторых европейских странах, напротив, секвенирование целых геномов стало широко доступным для людей с подозрением на генетические заболевания и рак через национальные службы здравоохранения. Но даже в этом случае анализ может быть ограниченным, оставляя неизученными большие участки, не связанные с белковым кодированием. «Для того чтобы получить наилучшие шансы на постановку генетического диагноза, необходимо изучить всю последовательность генома», - считает Дженни Тейлор, изучающая геномику человека в Оксфордском университете (Великобритания).
В то время как некоторые исследователи работают над продвижением секвенирования всего генома в качестве первоклассного диагностического метода для редких заболеваний, Тейлор и другие разрабатывают биоинформационные методы, помогающие максимально использовать данные, которые выдает тест. Другие же стремятся расширить доступность теста для малообслуживаемых групп населения и тем самым повысить его полезность для всех.
Родители Эммы Бродбент почти сразу поняли, что она не такая, как все. Широко расставленные глаза и низко посаженные уши, резко контрастировали с внешностью ее старшей сестры. «Она была очень милой», - вспоминает Брайан Бродбент, отец Эммы. Но уже через несколько недель он понял, что ухаживать за ней будет непросто. Она провела много времени в отделении интенсивной терапии новорожденных из-за проблем с легкими. После возвращения домой ей по-прежнему было трудно есть, ходить в туалет и даже дышать. «Иногда у нее задерживалось дыхание и тогда она синела», - вспоминает ее отец.
Когда Эмме было пять месяцев, Бродбентам позвонили поздно вечером в пятницу. Как они и ожидали, это были не очень хорошие новости. Врач подтвердил, что миелин в организме Эммы не вырабатывается и, вероятно, у нее лейкодистрофия. На следующее утро, - говорит Бродбент, «у меня включился режим "никогда не сдавайся" и я зашел на сайт clinicaltrials.gov». Он нашел исследование, проводимое неврологом и специалистом по лейкодистрофии Аделин Вандервер в Детской больнице Филадельфии. Вандервер проверяла, может ли секвенирование всего генома помочь людям с подозрением на лейкодистрофию быстрее поставить генетический диагноз.
Пока Эмма ждала начала обследования, ее невролог направил ее на секвенирование экзома, которое не выявило вариантов, вызывающих заболевание. Бродбенты были огорчены, узнав, что после такого секвенирования Эмма лишилась права участвовать в исследовании на полногеномное секвенирование. Вместо этого Вандервер предложил провести полное диагностическое обследование без секвенирования всего генома. «Мы прошли через все: метаболические тесты, рентген, она заново проанализировала наши экзомные данные. И в итоге у нас не было абсолютно ничего», - рассказывает Бродбент. Не желая сдаваться, он обратился в две организации, предлагающие бесплатное геномное секвенирование и анализ: Rare Genomes Project при Институте Броуда и Undiagnosed Diseases Network (UDN), которая финансируется Национальным институтом здоровья США и проводит подробную клиническую оценку группами специалистов, привлекаемых для каждого случая.
Специалисты UDN обнаружили вариант в коде, прилегающем к гену под названием CHD2. Известно, что дефицит CHD2 вызывает ряд неврологических расстройств, но проблема Эммы заключалась не в этом. В ее клетках содержалось больше мРНК CHD2 - ген был не дефицитным, а скорее сверхактивным. Бродбенты присоединились к группам поддержки в социальных сетях, посвященных заболеваниям, связанным с CHD2, и обнаружили, что симптомы Эммы не совпадают с теми, о которых сообщали другие семьи. Это открытие побудило исследователей из проекта «Rare Genomes (Редкие геномы)» внимательнее присмотреться к участку генома Эммы, связанному с CHD2.
Виджай Ганеш, невролог из больницы Brigham and Women's в Бостоне, который работал над данными Эммы в рамках своей постдокторской стажировки, обнаружил делецию ниже CHD2, в гене под названием CHASERR, который кодирует длинную некодирующую РНК. Как выяснилось, CHASERR модулирует CHD2, поэтому его делеция привела к тому, что клетки Эммы вырабатывали слишком много белка CHD2. Исследовательская группа разместила свои результаты на Matchmaker Exchange, сайте обмена данными, который помогает найти профили людей с одинаковыми заболеваниями или генетическими вариантами. В течение двух лет исследователи нашли еще два случая, подобных случаю Эммы, что позволило им описать, как оказалось, один из самых ранних примеров заболевания, вызванного вариантом длинной некодирующей РНК.
«Все это стоило того, чтобы узнать, что есть и другие семьи и что мы не одиноки», - говорит Бродбент, который поддерживает связь с другими семьями. Знание причины заболевания Эммы, которое называется синдромом Леннокса-Гастаута, также сняло часть неопределенности, которая висела над Бродбентами. «Мы не знаем, что нас ждет в будущем, но мы, по крайней мере, избавились от некоторых неизвестных», - говорит он.
За время работы в клинико-генетической лаборатории, которая занимается секвенированием образцов для UDN, Ли потерял счет случаям, когда секвенирование всего генома давало ответы, а секвенирование экзома - нет. «Это происходит постоянно», - говорит он.
В 2021 году UDN сообщила, что с помощью секвенирования полного генома был поставлен диагноз 41 из 67 пациентов, обратившихся в программу после того, как с помощью секвенирования экзома не удалось найти причинный вариант. Вандервер отмечает, что секвенирование всего генома полностью изменило область изучения лейкодистрофии, позволив диагностировать около 90% случаев, в то время как два десятилетия назад этот показатель составлял 40%. «И, вероятно, в этих некодирующих последовательностях скрыты десятки, если не сотни, других заболеваний», - говорит она.
В прошлом году американская компания Revvity, занимающаяся клиническим тестированием, провела ретроспективный анализ результатов геномного секвенирования 2100 человек. Компания обнаружила патогенные или потенциально патогенные варианты у 28% людей; около 9% из них были бы пропущены без полногеномного секвенирования. Войцик возглавила аналогичное исследование, в котором геномный анализ был применен к 744 нераскрытым случаям. Она и ее коллеги установили точные или вероятные генетические причины заболевания в 218 случаях. Из них около 8% случаев не были бы определены без секвенирования всего генома.
Хайди Рем, генетик и исследователь из Массачусетской больницы общего профиля в Бостоне, которая была одним из руководителей исследования Войцик, считает, что эти исследования занижают значение того, сколько еще случаев можно было бы раскрыть с помощью секвенирования целых геномов, если бы им была предоставлена такая возможность. «Я считаю, что ценность генома гораздо выше, чем 8%, но мы пока не можем интерпретировать большую часть вариаций в некодирующих регионах», - говорит Рем.
Геном человека может содержать пять миллионов вариантов, большинство из которых безвредны. Используя базы данных и эталонные геномы, ученые отсеивают распространенные варианты и выявляют те, которые имеют наибольший потенциал для возникновения заболеваний. Конечный результат зависит от того, на чем лаборатория сосредоточила свой анализ. «При секвенировании генома создается впечатление, что, поскольку вы собираете всю ДНК, вы рассматриваете ее в равной степени, но это совсем не так», - поясняет Ганеш. В клинических анализах, например, длинные некодирующие РНК, такие как CHASERR, обычно игнорируются, потому что большинство этих молекул содержат множество безвредных вариаций; только часть из них имеет решающее значение для функций клетки».
В исследовании, опубликованном в 2023 году, Тейлор возглавил международную команду, которая изучила геномные данные 122 нераскрытых случаев редких заболеваний. Комбинируя различные алгоритмы, исследователи смогли раскрыть 43 случая. Многие из найденных ими вариантов, вызывающих заболевания, находились в интронах - участках некодирующей ДНК, расположенных в гене вместе с кодирующей частью, экзонами. Обычно, когда ДНК транскрибируется в мРНК, интроны удаляются. Но изменение кода интрона может изменить этот процесс «сплайсинга» и тем самым нарушить производство мРНК и белков. Секвенирование экзома включает места сращивания, которые находятся в пределах нескольких десятков пар оснований экзона, но вызывающие болезнь варианты могут скрываться гораздо глубже в интронах, как это произошло с 15 вариантами, обнаруженными группой Войцика.
Тейлор говорит, что подобный глубокий анализ пока не может применяться в широких масштабах. В Великобритании, хотя люди с редкими заболеваниями регулярно проходят секвенирование всего генома, первоначальный анализ ограничивается генами, которые связаны с конкретными заболеваниями. Через государственную организацию под названием Genomics England частные лица могут предоставлять анонимные данные исследователям, которые затем могут делать более глубокие исследования и связываться с врачом человека, если находят что-то новое.
В одном из замечательных примеров этого процесса две исследовательские группы независимо друг от друга изучили данные британского проекта «100 000 геномов» и выявили варианты в малом ядерном РНК-кодирующем гене под названием RNU4-2 как основную причину редких нарушений нейроразвития. Одна группа специалистов выявила 73 случая, а другая - 115, изучив перекрывающиеся наборы данных, собранные из нескольких стран. По оценкам обеих групп, варианты в RNU4-2 вызывают 0,4% нарушений нейроразвития. "Этот диагноз был в геноме каждого человека неизвестно сколько времени", - говорит Ганеш. "Благодаря этим исследованиям сотни людей теперь имеют имя для своего заболевания - синдром ReNU - и создают сеть поддержки".
Конкретный диагноз, связанный с новым вариантом гена, часто требует дополнительных шагов, таких как секвенирование РНК или выращивание клеточных культур и измерение уровня белка - как это было сделано в случае с Эммой. Но, по утверждению Ганеша, «наша работа в рамках проекта „Редкие геномы“ показывает, что для постановки многих из этих диагнозов просто необходим весь геном». Зачем этим пациентам совершать такую диагностическую одиссею, если у вас есть жизнеспособный тест, который можно получить и интерпретировать довольно простым способом, чтобы определить причинные варианты?»
Люди с редкими заболеваниями в среднем проводят пять лет в попытках установить диагноз. Многие исследователи и клиницисты считают, что подход «геном превыше всего» может сократить это время и сэкономить деньги за счет отказа от серийного тестирования. В прошлом году консорциум американских институтов и лабораторий под названием «Медицинская геномная инициатива» призвал к разработке политики, направленной на обеспечение равного доступа и всеобщего страхового покрытия для секвенирования всего генома в качестве диагностического теста первого уровня для редких заболеваний. Рем, который входит в руководящий комитет инициативы, говорит, что генные панели уместны, когда клиническая оценка четко указывает на вероятный диагноз, но «все, где клинический диагноз находится в стадии уточнения и может быть неоднозначным, должно проводиться на основе генома».
По мнению Ли, полногеномное секвенирование также может уменьшить потребность в эксперте при выборе генетических тестов, на которые следует направить человека. Его группа получила грант от Национального института исследования генома человека США на проведение секвенирования всего генома и РНК в отделениях интенсивной терапии в сельских районах Техаса, где люди практически не имеют доступа к генетическим тестам и анализам. В рамках проекта будет использоваться телемедицина для предоставления генетических консультаций и руководства местными врачами в процессе диагностики.
В глобальном масштабе другая американская некоммерческая организация Genetic Alliance делает доступным секвенирование всего генома в странах с низким и средним уровнем дохода в рамках программы под названием iHope. Цель программы - покрыть расходы на диагностику детей с редкими заболеваниями, но у проекта есть и дополнительные преимущества - в частности, он помогает обнаружить варианты, связанные с заболеваниями, через такие сайты, как Matchmaker Exchange, и повышает разнообразие и богатство глобальных геномных баз данных, когда семьи решают предоставить свои данные для исследований.
Бродбент, который в настоящее время является сопрезидентом Коалиции за излечение CHD2, говорит, что продолжать поиски диагноза Эммы его побудило осознание того, что не у всех семей есть ресурсы для того, чтобы сделать то же самое. «Я чувствовал ответственность как перед своей дочерью, так и перед другими семьями за то, чтобы продвинуться как можно дальше», - говорит он. Бродбент особенно гордится тем, что диагноз Эммы открыл терапевтические возможности для лечения дефицита CHD2.
«CHASERR - это не просто генетическое открытие для нашей семьи», - говорит он. И хотя вероятность того, что открытие CHASERR приведет к излечению Эммы, которая в свои восемь лет не может ни ходить, ни говорить, невелика, он говорит, что «вероятность излечения от чего-то, если вы не знаете, что это такое, равна нулю».
