Бактериальный секретом включает в себя полипептиды, экспрессируемые на поверхности клетки или выделяемые во внеклеточную среду, а также соответствующие механизмы секреции.
Несмотря на ограниченные возможности кодирования, Mycoplasma spp. способны производить и выделять в окружающую среду несколько компонентов, включая полипептиды, экзополисахариды и внеклеточные везикулы. Технические трудности с очисткой этих элементов из сложных бульонных сред, используемых для выращивания микоплазм, были недавно преодолены путем оптимизации условий роста и перехода на химически заданные культуральные среды. Однако пути секреции, ответственные за выделение этих структурно разнообразных элементов, у микоплазм все еще плохо описаны. Мы предлагаем использовать термин "релиасом" вместо термина "секретом" для обозначения молекул, выделяемых микоплазмами в окружающую среду.
Целью данного обзора является более точное определение элементов, которые следует считать частью микоплазменного релиасома, и их роли во взаимодействии микоплазм с клетками и тканями хозяина.
Термины
Релиасом: совокупность не прикрепленных к клетке молекул (белков, полисахаридов, ДНК и метаболитов) и элементов, выделяемых живой клеткой во внеклеточную среду, независимо от механизма выделения/секреции, но исключая выделение при лизисе клетки и загрязнение компонентами среды. В отличие от секретома, механизм секреции может быть неизвестен.
Секретом: классически определяется как совокупность белков и соответствующих им систем секреции, обеспечивающих транслокацию через мембрану изнутри клетки наружу. Это подразумевает, что системы секреции известны.
Экзопротеин: белок, выделяемый жизнеспособными микоплазмами в окружающую среду. Сюда не входят прикрепленные к клетке белки.
Экзопротеом: набор экзопротеинов, секретируемых клеткой в определенное время и в определенной среде.
Внеклеточная везикула (EV): наноразмерная, мембранная сферическая структура, образованная из жизнеспособных клеток путем почкования. EV состоят из части мембраны и цитоплазмы родительской клетки, но в результате селекции грузов их состав не совпадает с составом родительской клетки.
Клеточно-связанный полисахарид (CPS): полисахарид, ковалентно связанный с поверхностью клетки. Полученный полимер остается прикрепленным к клетке, где он может образовывать капсулу или слой вокруг клеток. CPS очищают из промытых клеток.
Экзополисахарид (EPS): полисахарид, нековалентно связанный с поверхностью клетки и свободно выделяющийся в супернатанте культуры или внутри хозяина. Такие полисахариды очищают in vitro из бесклеточного супернатанта.
Термин бактериальный секретом был введен в самом начале 21 века для описания "компонентов механизмов секреции белков и собственных секретируемых белков", при этом основное внимание уделялось системам секреции, т.е. механизмам, участвующим в транслокации мембран. С тех пор определение секретома регулярно пересматривалось, чтобы больше сосредоточиться на конечной локализации секретируемых белков и их потенциальных различных ассоциированных функциях.
В настоящее время понятие секретома включает в себя белки, находящиеся на поверхности (поверхностный протеом), белки, высвобождающиеся в свободном виде (не прикрепленные к клеткам) в бактериальную среду (экзопротеом) и белки, встроенные во внеклеточные везикулы (протеовезикулом). Бактериальный секретом играет ряд ролей во взаимодействии с хозяином (включая адгезию, инвазию, уклонение от иммунитета и модуляцию), получении питательных веществ и взаимодействии между бактериальными клетками. Некоторые из этих взаимодействий являются конструктивными, например, образование биопленки, другие могут быть негативными, например, конкуренция.
Многие белки, участвующие в вирулентности, находятся в секретоме, и характеристика этих белков важна для понимания взаимодействия хозяина и патогена и, в конечном счете, для разработки подходящей стратегии борьбы с заболеваниями. Однако, хотя большая часть литературы посвящена секретируемым белкам, другие полимеры, такие как полисахариды, также экспортируются бактериями и выполняют различные функции в зависимости от их конечного местоположения, т.е. прикреплены они к клеткам или нет.
В данном обзоре мы предлагаем:
(i) расширить понятие бактериального секретома, включив в него неполипептидные молекулы, такие как полисахариды, и более сложные элементы, такие как внеклеточные везикулы (EV), и
(ii) переименовать эту более широкую группу компонентов в релиасом, чтобы учесть пробелы в знаниях о механизмах секреции в некоторых бактериальных моделях (что особенно актуально для микоплазм) и сместить фокус исключительно на неклеточные элементы, выделяемые живыми клетками.
Полисахариды - это длинноцепочечные полимеры, состоящие из сахаров, соединенных гликозидными связями. Внеклеточные полисахариды либо прикреплены к клетке и образуют капсулу или слой вокруг клетки, либо выделяются в виде внеклеточных полисахаридов в непосредственное окружение бактерии. Общий термин "экзополисахариды" был предложен в 1972 году для описания этих двух внеклеточных локализаций. Во многих исследованиях, посвященных экзополисахаридам, не удается четко определить их точную локализацию (свободная или прикрепленная к клетке). Однако очень важно проводить различие между экзополисахаридами, связанными с клетками и не связанными с клетками, поскольку эти две формы могут играть различную роль во взаимодействии с хозяином.
В данном обзоре, в целях пояснения, мы используем аббревиатуру для обозначения клеточно-связанных полисахаридов (CPS), которые могут образовывать капсулу или оболочку вокруг клетки, а термин экзополисахариды (EPS) мы используем строго для обозначения внеклеточных полисахаридов. Тот факт, что состав и структура молекулы полисахарида могут быть идентичными с одним общим путем биосинтеза, может затруднить различие между CPS и EPS: например, стрессы могут высвобождать CPS в окружающую среду, а такие структуры, как биопленки, могут затруднить оценку прикрепления клеток.
Внеклеточные везикулы являются наиболее сложными структурами релиасома, поскольку они состоят из липидов, белков, гликоконъюгатов и нуклеиновых кислот. Их состав отражает их биогенез из клетки. Бактериальные EV определяются как нерепликативные, мембранные сферические структуры размером 20-400 нм, которые секретируются жизнеспособными клетками.
Определение релиасома особенно подходит для бактерий рода Mycoplasma, для которых системы секреции плохо известны или плохо предсказуемы in silico. Микоплазмы, т.е. бактерии, принадлежащие к роду Mycoplasma - это маленькие (300-800 нм в диаметре), лишенные стенок бактерии, имеющие только фосфолипидную, богатую холестерином бислойную мембрану, окружающую цитоплазму. Высвобожденные молекулы "просто" транслоцируются через цитоплазматическую мембрану, что является более простой ситуацией, чем у бактерий Грам+ и Грам-.
Из-за своего небольшого генома, кодирующего менее 1000 белков, и скудности метаболических путей микоплазмы считаются простейшими бактериями, способными реплицироваться в ацеллюлярной среде. Первые свидетельства о выделении микоплазмами внеклеточных молекул исторически связаны с первой культурой (в 1898 году) M. mycoides subsp. mycoides, возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота (CBPP) (Nocard and Roux, 1898).
Авторы использовали коллодионный мешок, содержащий бульон, инокулированный серозной легочной жидкостью от больной CBPP коровы и помещенный в перитонеальную полость кролика. Микоплазмы смогли выжить и расти внутри этого непермиссивного хозяина, поскольку коллодионный мешок был проницаем для выделяемых хозяином питательных веществ, но обеспечивал защиту от иммунной системы кролика (Bove, 1999). В их работе также были найдены доказательства того, что коллодионный мешок выделял продуцируемый микоплазмой компонент, который вызывал некроз в окружающих тканях и мог способствовать развитию кахексии у кролика (Lloyd, 1966).
Другие исследования 1960-1970-х годов продемонстрировали некоторые внеклеточные молекулы, выделяемые микоплазмами, такие как полисахариды или антигены, выделенные из жидкостей организма инфицированных CBPP животных, наноразмерные глобулярные элементы, наблюдаемые при микроскопии в бульонных культурах M. pneumoniae, и неохарактеризованные молекулы, обладающие цитотоксической активностью в супернатанте культур M. bovigenitalium. Однако исследователи того времени не смогли точно определить химическую структуру этих элементов, поскольку не смогли очистить их от компонентов сложной ростовой среды или из жидкостей организма. В последнее время эти узкие места в экспериментах были устранены с помощью различных стратегий.
Микоплазмы активно выделяют в окружающую среду широкий спектр молекул и элементов - от метаболитов до белков, полисахаридов, ДНК и EV. Не все эти элементы связаны с известной системой секреции, но их общая внеклеточная локализация дает основание объединить их под общим термином релиасома. Характеристика релиасомы Mycoplasma spp. началась с первой культуры микоплазмы в 1898 году. По аналогии с другими бактериями, первыми искомыми внеклеточными элементами были токсины и другие факторы вирулентности.
Несмотря на методологические недостатки того времени, протеазы, липазы и нуклеазы во внеклеточной среде были обнаружены довольно рано, но соответствующие механизмы секреции и их субстраты не были идентифицированы. Со временем возникла другая трудность, поскольку большинство высвобождаемых элементов или их частей также имеют клеточно-локализованный аналог, который может иметь другую функцию, что подчеркивает тесную связь между релиасомой и поверхностью клетки. EVs играют важную роль в релиасоме, поскольку они могут содержать белки, полисахариды и ДНК в защищенной среде. Физическая форма (свободная или связанная с EV) различных элементов релиасомы может изменять их роль, как это было описано для LPS-индуцированной активации инфламмасомы у P. aeruginosa (Bitto et al., 2018).
Данные, собранные для целей настоящего обзора, показывают, что элементы релиасома в настоящее время признаны играющими важную роль в получении питательных веществ, адгезии к клеткам хозяина и вторжении в них, а также в модуляции и уклонении от иммунной системы. Однако лучшее понимание глобальной роли и динамики релиасома зависит от изучения баланса его различных компонентов (белков, полисахаридов, метаболитов и EV) в точный момент времени после инфицирования хозяина, в различных участках хозяина, в конкретных физиологических состояниях микоплазм, включая их внутриклеточность.
Дальнейшие успехи в расшифровке релиасома микоплазм принесут дополнительные знания и гипотезы о взаимодействии между микоплазмами и их хозяевами и помогут продвинуться в идентификации новых молекул, участвующих в вирулентности, или цитоплазматических или мембранных молекул, выполняющих различные роли после их высвобождения из клетки.
Такие факторы вирулентности не включены в существующие инактивированные вакцины. Более того, модификации экзопротеома наблюдались после серийного пассажа in vitro (Zhang et al., 2021), что указывает на то, что релиасом аттенуированных вакцинных штаммов может отличаться от релиасома вирулентных полевых штаммов. В конечном итоге необходимы эксперименты для оценки пользы от добавления компонентов релиасома к существующим вакцинам.
