Enterobacterales, продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) (ESBL-PE), должны рассматриваться клиниками, как критическая угроза.
Инфекции, вызванные ESBL-PE, ассоциируются с повышенной заболеваемостью, смертностью и более высокими затратами на здравоохранение. Несмотря на признание непосредственного влияния на здоровье человека, важные аспекты молекулярной эпидемиологии ESBL-PE остаются в значительной степени неизученными. В частности, не хватает знаний о возможностях конкретного штамма сохраняться в организме хозяина в течение длительных периодов времени, о количестве мутаций, происходящих в организме хозяина во время колонизации, и о генетическом разнообразии колонизирующих и инфицирующих изолятов у отдельного пациента и с течением времени.
Такие знания крайне важны для более глубокого понимания эпидемиологии ESBL-PE, требующего данных о резервуарах и цепочках передачи, их жизнеспособности и, следовательно, их потенциальной возможности сохраняться во времени. Кроме того, изучение мутаций бактерий в организме может дать важные знания о взаимодействии хозяина и патогена, необходимом для успешной колонизации и последующего инфицирования. До настоящего времени колонизация ESBL-PE изучалась в основном у предположительно "здоровых" возвращающихся путешественников или пациентов с ограниченным периодом наблюдения, обычно не превышающим 24 месяца. Кроме того, в этих исследованиях в основном отсутствуют подробные полногеномные анализы.
В нашем учреждении пациенты, колонизированные ESBL-PE, регулярно обследуются при каждой госпитализации, и систематически отбирается как минимум один изолят ESBL-PE, выделенный при обычном клиническом анализе. В данной работе мы изучили внутрихозяинное генетическое разнообразие колонизирующих и инфицирующих штаммов ESBL-Klebsiella pneumoniae и ESBL-Escherichia coli и их плазмид путем секвенирования этих штаммов, собранных за 10-летний период из различных скрининговых и клинических образцов.
Данное исследование дает представление о возможности длительной колонизации ESBL-PE в когорте пациентов, поступивших в медицинский центр, генетических изменениях этих микроорганизмов с течением времени, генетическом разнообразии между колонизирующими и инфицирующими изолятами и между различными местами колонизации и инфекции. Мы оценили персистенцию штаммов и плазмид в пределах одного хозяина и проанализировали, как изоляты одного и того же кластера/штамма изменялись с течением времени. Кроме того, мы оценили передачу плазмид между различными штаммами или видами у одного и того же пациента.
Один и тот же штамм ESBL-PE сохранялся до пяти (K. pneumoniae) или девяти (E. coli) лет, что дольше, чем сообщалось ранее для обоих видов. Это также отличается от сообщений о персистенции ESBL-PE у здоровых путешественников, в которых носительство ESBL-PE было обнаружено лишь у нескольких пациентов (11%) через 12 месяцев. Хотя дизайн нашего исследования не позволяет сделать выводы о точной продолжительности колонизации, он указывает на возможность длительной колонизации, продолжающейся от нескольких месяцев до нескольких лет у пациентов с уже существующими заболеваниями.
У пациентов с изолятами, выделенными из разных участков тела, один и тот же штамм часто встречался в разных участках и был связан как с инфекцией, так и с колонизацией, что совпадает с результатами предыдущих исследований. Наблюдалось сохранение колонизации одним и тем же штаммом после инфицирования, а также рецидивирующие инфекции у пациентов с первоначальной колонизацией.
Некоторые пациенты были носителями дополнительных изолятов ESBL-PE с различным генетическим фоном, как описано в других исследованиях. Тот факт, что пациенты могут быть колонизированы генетически различными штаммами одного и того же вида или разных видов, подразумевает необходимость отбора разных колоний для фенотипического и генотипического тестирования с целью обоснования индивидуальных решений о лечении и изучения передачи инфекции.
В некоторых случаях наблюдалось большее количество SNP (Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм) между первым и вторым изолятами одного кластера, в отличие от более поздних изолятов. Это может свидетельствовать о более ранней колонизации пациента (до начала исследования), поскольку в случае недавней колонизации все изоляты должны быть более генетически схожими. Однако в процессе колонизации количество различий SNP по отношению к первому колонизирующему изоляту пациента остается практически стабильным. Предполагаемые скорости мутаций порядка 10e-06 - 10e-07 соответствуют данным, полученным для этих видов. Количество SNPs, обнаруженных в изолятах одного и того же штамма у одного и того же пациента, служит основой для установления реалистичных пределов при оценке передачи инфекции от пациента к пациенту, причем не только для ESBL-PE.
В целом, элементы, ассоциированные с плазмидами, были общими между изолятами одного и того же пациента, даже если они не принадлежали к одному и тому же штамму/кластеру, что свидетельствует о горизонтальном переносе генов. Наличие одинакового набора AMR-генов и репликонов во всех изолятах является дополнительным признаком персистенции носительства AMR-плазмид, включая ESBL-плазмиды, что было подтверждено с помощью секвенирования с длинным прочтением в определенной части изолятов. Кроме того, реконструкция ESBL-плазмид по данным секвенирования с длинным прочтением позволила выявить передачу целых ESBL-плазмид между различными штаммами у одного и того же пациента.
Наше исследование имеет ряд ограничений, включая одноцентровый дизайн и несистематический отбор образцов. В связи с лонгитюдным дизайном, длившимся от нескольких месяцев до нескольких лет у отдельных пациентов, и нестандартизированным наблюдением, невозможно было оценить информацию о воздействии антимикробных препаратов. Поскольку критерием включения в исследование было обнаружение ESBL-PE как минимум в двух последовательных мазках из прямой кишки, а мазки из прямой кишки систематически берутся при поступлении в стационар, исследуемая популяция может быть смещена в сторону более "больных" пациентов, нуждающихся в повторной госпитализации.
Большинство изолятов было получено из мазков из прямой кишки, что ограничивает возможность обобщения на другие участки тела. Поскольку обследование других участков тела является частью нашей институциональной политики, ограниченное количество изолятов, выделенных из других участков, таких как мочеполовой тракт, отражает персистенцию, происходящую в основном в желудочно-кишечном тракте. Поскольку для выделения отбирались не все колонии (а только те, которые отличались по морфологии), разнообразие изолятов, колонизирующих или инфицирующих отдельного пациента, могло быть недооценено.
Дизайн нашего исследования и размер выборки лишь частично позволяли выявить различия в характеристиках пациентов и штаммов, потенциально связанных с краткосрочной и долгосрочной колонизацией. Пациенты с потенциальной краткосрочной колонизацией были исключены, поскольку они не соответствовали критериям включения в исследование, требующим обнаружения колонизирующих штаммов как минимум в двух последовательных образцах для скрининга. Хотя для решения этого вопроса необходимы дальнейшие исследования, мы хотели бы обратить внимание на особую сложность классификации пациентов как "краткосрочно колонизированных", связанную с возможностью предвзятости выборки и обнаружения (т. е. репрезентативности скрининговых образцов для исключения постоянной колонизации и чувствительности диагностических подходов для выявления постоянной колонизации). Таким образом, пациенты могут быть классифицированы как колонизированные в течение короткого периода времени на основании отрицательных результатов отбора проб, несмотря на то, что они все еще колонизированы. Это подтверждается результатами различных исследований по деколонизации, которые показывают краткосрочный успех, но долгосрочный провал таких схем.
В нашем исследовании не было достаточного количества данных для анализа ассоциаций между геномными характеристиками колонизирующих штаммов и клинической картиной колонизации и инфекции. Тем не менее, обнаруженный нами факт, что большинство штаммов, идентифицированных в контексте инфекции, были идентичны штаммам, идентифицированным в контексте колонизации, позволяет предположить, что решающее значение для перехода от колонизации к инфекции имеют свойства хозяина, а не бактерий. Наше исследование не было направлено на изучение потенциальной потери ESBL-содержащих плазмид и потенциальной персистенции бактериальных штаммов после потери ESBL-содержащих плазмид у отдельных пациентов.
Главным достоинством данного исследования является его лонгитюдный дизайн, рассчитанный на десятилетний период, и большое количество образцов, проанализированных у некоторых пациентов, что позволяет отслеживать генетическое разнообразие штаммов в течение длительного времени и на разных участках тела. Предыдущие лонгитюдные исследования, посвященные детальному изучению генетических изменений колонизирующих бактерий, и в частности ESBL-PE, в основном длились от нескольких месяцев до одного или двух лет. Наш дизайн позволил нам изучить изменчивость среди персистирующего комплекса видов ESBL-K. pneumoniae и штаммов ESBL-E. coli у одного и того же пациента и с течением времени, в некоторых случаях до девяти лет.
Более того, мы получили полные геномы и плазмиды для некоторых изолятов с помощью секвенирования с длинным прочтением, которые послужили эталонами для последующих анализов и внесут вклад в каталог общедоступных геномов. Результаты данного исследования могут послужить ценной основой для дальнейших исследований, направленных на анализ факторов штамма и хозяина, связанных с продолжительностью колонизации и переходом от колонизации к инфекции, поскольку они позволяют оценить генетическое разнообразие комплекса ESBL-продуцирующих E. coli и K. pneumoniae, которое можно ожидать у отдельных пациентов с течением времени.
В заключение следует отметить, что разнообразие ESBL-продуцирующих E. coli и комплекса видов K. pneumoniae среди пациентов, поступающих в медицинский центр, невелико, и пациенты могут оставаться колонизированными одним и тем же штаммом в течение девяти лет. Мобильные генетические элементы часто являются общими для изолятов ESBL-PE одного и того же хозяина. Пациенты, колонизированные ESBL-продуцирующими бактериями E. coli и видами комплекса K. pneumoniae, могут служить долговременным резервуаром для постоянной передачи ESBL и подвержены риску повторного инфицирования колонизирующими штаммами.
