Диарейные заболевания являются основной причиной детской смертности в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно среди детей в возрасте до 5 лет, и часто вызываются диареегенной Escherichia coli (DEC).
Существует несколько патотипов кишечной палочки, ассоциирующихся с диареей, в том числе: шига-токсин-продуцирующий (STEC; часто ассоциируется со вспышками заболеваний пищевого происхождения, включая O157:H7), энтеротоксигенный (ETEC), энтеропатогенный (EPEC), энтероагрегационный (EAEC), энтероинвазивный (EIEC) и диффузно-адгезивный (DAEC). Каждый патотип несет в себе различные наборы генов вирулентности, обусловливающих его собственный способ патогенности. Например, ETEC идентифицируется по наличию генов lt и/или sta, которые кодируют термолабильные и термостабильные токсины, соответственно.
Эффективное лечение диарейных заболеваний и управление вспышками зависит от точной идентификации штаммов DEC. Культивирование из образца кала с последующим проведением биохимических анализов и/или молекулярных методов, таких как ПЦР, является традиционным способом идентификации некоторых бактериальных патогенов и диагностики энтеральных заболеваний. В настоящее время существует несколько селективных сред для относительно быстрого (12-24 часа) выращивания возбудителей энтеральных инфекций.
Вместе с тем амплификация генов вирулентности из культивируемых изолятов с помощью ПЦР признана несовершенным подходом к точной диагностике. Кроме того, культивирование требует значительных ресурсов и времени, его нелегко масштабировать на сотни или тысячи образцов, а выявление специфических для патогена генов вирулентности ограничивается известными патотипами. Например, в одном из недавних исследований более трети пациентов с диареей путешественников были патогеннегативными по результатам культуральной диагностики, но при этом реагировали на лечение антибиотиками, что свидетельствует о том, что возбудитель не был идентифицирован. Биохимические анализы культивированных изолятов, например, выявление штаммов, ферментирующих лактозу на селективных средах, могут подтвердить результаты ПЦР, но только демонстрируют способность возбудителя к метаболизму, что не всегда связано с вирулентностью или этиологией возбудителя. Кроме того, амплификация отдельных генов из культивируемых изолятов E. coli не дает информации о геномном разнообразии организмов на уровне штаммов in situ, что ограничивает ее полезность для отслеживания вспышек или понимания динамики популяции патогена и эпидемиологии.
Полногеномное секвенирование (WGS) преодолевает некоторые ограничения ПЦР и становится все более полезным инструментом в эпидемиологических исследованиях и в установлении связи между патогенностью и разнообразием на уровне штаммов. Однако WGS зависит от культивирования и, следовательно, ограничена в перечисленных выше аспектах. Кроме того, погрешности при выделении могут повлиять на результаты и, следовательно, на дальнейшую диагностику. Штаммы с низким содержанием (теоретически даже одна клетка) и/или не являющиеся возбудителем инфекции, могут расти на селективных средах, что вносит путаницу в интерпретацию. Поэтому необходимо разработать независимые от культуры методы для установления связи между генотипами патогенов и исходами заболеваний, особенно для сообществ с ограниченными ресурсами, где передача возбудителей диареи высока из-за ограниченной инфраструктуры водоснабжения, санитарии и гигиены.
Метагеномное секвенирование методом дробовика представляет собой многообещающую альтернативу проблемам, связанным с подходами на основе культур и WGS. Амплифицируя все геномные фрагменты в образце, метагеномика обеспечивает подход к оценке численности бактериальной популяции и внутрипопуляционного разнообразия в образце, связанном с хозяином. Последние достижения биоинформационных методов, включая получение метагенома популяции (MAG), который представляет собой консенсусную геномную последовательность микробной популяции в образце, позволяют получить как качественную (наличие/отсутствие патогенов), так и количественную (относительная численность) информацию о микробных таксонах.
Эти подходы использовались, в частности, для дифференциации микробиома кишечника бессимптомных и симптоматических пациентов с норовирусом, отслеживания изменений в легочной микробиоте пациентов с муковисцидозом во время лечения, извлечения геномов E. coli при вспышке STEC, диагностики коинфекций и диагностики пациентов с острым холециститом. Однако, как и все молекулярные методы, клиническая диагностика на основе метагеномов имеет свои ограничения. В частности, низкий титр патогена или высокий уровень ДНК хозяина могут препятствовать адекватному секвенированию генома патогена. Кроме того, высокопроизводительное секвенирование и биоинформационный анализ могут быть сложными, особенно в условиях ограниченных ресурсов.
Несмотря на то, что метагеномные технологии еще не стали стандартной клинической методикой, исследования, сравнивающие их с традиционными подходами, показали, что метагеномные данные могут быть ценными для понимания этиологии заболевания, даже если инфекции вызваны редкими или труднодиагностируемыми патогенами. Метагеномные технологии могут также предоставить данные об эволюции и распространении патогенов, которые невозможно получить с помощью традиционных методов, отчасти потому, что они позволяют избежать ограничений, связанных с культуральными методами.
Современные метагеномные исследования позволили получить последовательности геномов микробных патогенов из микробиомов кишечника человека, что дает возможность связать геномику патогенов с исходами заболеваний вне зависимости от культивирования. MAG, в отличие от генома культивируемого изолята, обычно не обеспечивает разрешения на уровне штамма, особенно когда несколько близкородственных штаммов совместно встречаются и собираются в один консенсусный MAG, или когда низкая численность препятствует точной сборке. Однако MAG обычно представляет собой наиболее распространенный генотип (или штамм) в исследуемой популяции, и сопоставление коротких считываний с собранными последовательностями MAG может дать количественные данные о распространенности и внутрипопуляционном разнообразии последовательностей и генов как для патогенов, так и для комменсальных таксонов кишечника.
Недавно мы разработали биоинформационный рабочий процесс для идентификации возбудителя диареи, сопутствующей DEC-инфекции, путем применения комбинации критериев к геномным последовательностям культивированных изолятов из клинического образца (стула), включая относительное обилие генома изолята в соответствующем клиническом метагеноме на основе коротких чтений, наличия/отсутствия генов вирулентности в метагеноме и филогенетического размещения MAGs относительно эталонной филогении генома изолята и выбранных (доступных) геномов патогенов и комменсальных родственников. Эти критерии обеспечивают строгую основу для точной идентификации патогенов и добавляют дополнительные аспекты к данным пациентов, которые не могут быть получены с помощью культуральных методик.
В данном исследовании мы сравнили рабочий процесс метагеномного секвенирования, описанный нами ранее, с традиционными культурально-зависимыми подходами для идентификации и оценки численности DEC. Мы использовали ранее собранные данные из крупного популяционного исследования носительства патогенных E. coli и острой диареи, проведенного на севере Эквадора. Наша цель состояла в том, чтобы определить, насколько точно наша метагеномная стратегия восстановления генов с помощью коротких чтений и биннинга MAG (в метагеномике биннинг - это процесс группировки считываний или контигов и присвоения их отдельному геному - прим.ред.) отражает изоляты и патотипы, полученные с помощью общепринятых методов культивирования и ПЦР, и обеспечивает ли метагеномика или культивирование более точное представление популяций патотипов E. coli в кишечнике. Мы выделили MAG из определенной части образцов и сравнили их патотип с идентичностью изолятов, выделенных из тех же образцов с помощью секвенирования генома и ПЦР.
В данном исследовании мы сравнили идентификацию DEC с помощью культуры с метагеномным секвенированием образцов цельного стула, используя 35 случайно взятых образцов из когорты пациентов, страдающих диареей. Метагеномное секвенирование выявило изоляты в 97% образцов, что в целом свидетельствует о надежности их обнаружения с помощью данного подхода. Биннинг генома позволил получить высококачественные геномы E. coli, собранные в метагеном (MAG), для 13 образцов, и мы обнаружили, что MAG не нес диагностических генов вирулентности DEC соответствующего изолята в 60% этих образцов.
В частности, наблюдались два различных сценария: диффузно адгезивные изоляты E. coli (DAEC) без соответствующих DAEC MAGs, по-видимому, были относительно редкими членами микробиома, что было подтверждено количественной ПЦР, и поэтому вряд ли представляли этиологический агент в 3 из 13 образцов (~23%). В отличие от этого, гены вирулентности ETEC располагались на плазмидах и в основном не попадали в ассоциированные MAG, несмотря на то, что были распространены в образцах (5/13 образцов или ~38%), что свидетельствует об ограничениях метагеномного подхода. Эти результаты дают важные сведения для диагностики инфекций DEC и демонстрируют, как метагеномные методы могут дополнять усилия по выделению и ПЦР для идентификации патогенов и определения численности популяции.
Метагеномные подходы обеспечивают важнейший контекст для DEC и других энтеральных заболеваний помимо информации, предоставляемой культивированными изолятами. Представления об относительной численности целевых штаммов и идентификация совместно встречающихся штаммов, полученные с помощью метагеномики, могут информировать исследователей и клиницистов о составе патогенных популяций E. coli у пациентов, страдающих диареей или другими кишечными расстройствами. В данном исследовании мы продемонстрировали, что использование комбинации диагностического восстановления генов вирулентности DEC на основе чтения и MAG-анализа является выгодным подходом к получению этих показателей и дополняет информацию, полученную с помощью ПЦР.
Примечательно, что этот метод может быть легко распространен на другие патогенные линии энтеральных бактерий, включая Salmonella и Campylobacter. Однако патотипическая идентичность присутствующей E. coli сыграла важную роль в эффективности нашего метагеномного рабочего процесса для обнаружения DEC; мы выяснили, что различные патотипы требуют различных аналитических подходов. В частности, инфекции DAEC легко идентифицировались с помощью картирования последовательностей генов вирулентности и часто MAGs, в то время как инфекции ETEC легко идентифицировались с помощью картирования последовательностей генов вирулентности, но не MAGs.
Сложность идентификации инфекций ETEC только по MAG подчеркивает некоторые недостатки биоинформационных подходов, а именно вычислительные проблемы, связанные с идентификацией и бинингом последовательностей генов вирулентности, кодируемых плазмидами. Теоретически MAG также представляют наиболее распространенных членов сообщества (поскольку более высокая частота считывания в целом обеспечивает лучшие бины); на практике существуют особенности генома (например, плазмиды и высокое внутрипопуляционное разнообразие), которые могут препятствовать эффективному бинингу даже при высокой численности популяции. Однако последние технологические достижения, такие как быстрое секвенирование с длинным прочтением с помощью технологии Nanopore и биннинг на уровне штаммов, позволяют предположить, что эти технологии станут важным компонентом клинической диагностики. Поэтому существует потребность в универсальных метагеномных конвейерах, включающих как новые технологии секвенирования, так и традиционные методы, основанные на культивировании.
В совокупности, наша работа показала, что, несмотря на определенные ограничения, накладываемые метагеномным секвенированием для идентификации DEC, они могут быть преодолены с помощью комбинации биоинформационных аналитических подходов, которые постоянно совершенствуются. Эта работа также внесла вклад в стандартизацию биоинформационных конвейеров, оценив различные метрики (например, TAD80) и выявив области, требующие улучшения в метриках бининга генома и покрытия. Развертывание этого аналитического конвейера с помощью таких рабочих систем, как NextFlow, может еще больше ускорить и упростить анализ в условиях ограниченных ресурсов.
В целом, мы пришли к выводу, что сочетание восстановления генов на уровне чтений и MAG-анализа эффективно для выявления DEC в образцах микробиома человека, обеспечивая необходимый следующий шаг на пути к оптимизации диагностики DEC, а также дополняя существующие методы.
