Резистентность к противогрибковым препаратам вносит значительный вклад в проблему AMR, особенно среди пациентов с ослабленным иммунитетом.
Множество биологических, социальных и экономических факторов приводят к сотням миллионов серьезных грибковых инфекций и от 1 до 1,5 миллионов смертей от грибковых инфекций в год во всем мире. AMR у грибков вызывает особое беспокойство из-за ограниченного числа классов лекарств, доступных для лечения инвазивных грибковых инфекций (т.е. фунгистатических азолов, а также фунгицидных полиенов и эхинокандинов). Эта угроза усугубляется тем, что за более чем десятилетие на рынке не появилось ни одного нового класса противогрибковых препаратов. Прогнозируется, что изменение климата также увеличит распространенность грибковых инфекций, поскольку грибки адаптируются к более теплым температурам, чтобы расширить свой географический ареал и преодолеть теплозащитный барьер своих теплокровных хозяев.
Виды Candida являются наиболее распространенными причинами грибковых инфекций. Одним из видов Candida, который вызывает все большую озабоченность, является Candida auris, из-за его резистентности к противогрибковым препаратам и вспышек заболеваний, связанных с оказанием медицинской помощи. В настоящее время C. auris обнаружен на всех обитаемых континентах и более чем в 47 странах. Особую тревогу вызывает тот факт, что C. auris обладает множественной лекарственной резистентностью, а в некоторых случаях была обнаружена панрезистентность. Смертность от C. auris достигает 45% среди пациентов с инфекциями кровотока.
Толерантность - это явление, при котором во время лечения противогрибковыми препаратами возникает медленно растущая субпопуляция клеток, которые считаются генетически идентичными восприимчивым клеткам. Противогрибковая толерантность отличается от противогрибковой резистентности тем, что резистентность является результатом наследственных генетических изменений, а резистентные клетки растут выше минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в зависимости от концентрации (т.е. МИК увеличивается при резистентности, но не увеличивается при толерантности).
Толерантность - это обратимое явление, при котором клетки медленно растут выше МИК (т.е. они демонстрируют рост при "супра-МИК"). Толерантность проявляется в результате фенотипической гетерогенности, присущей данному грибковому изоляту, так что любая клетка в изогенной популяции может воспроизводить доли чувствительных и толерантных клеток, присутствующих до начала противогрибкового лечения. Перекрестная толерантность наблюдается у C. albicans, когда штаммы, толерантные к позаконазолу, проявляют толерантность и к другим азольным препаратам.
Хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе толерантности у видов Candida, все еще в значительной степени неизвестны, предварительные исследования показали, что толерантность связана с несколькими генетическими компонентами, которые различаются между изолятами, включая Hsp90-фасилитированную толерантность к азолам у C. auris. Также было показано, что анеуплоидия изменяет резистентность к противогрибковым препаратам у C. albicans. Неизвестно, толерантна ли C. auris к неазольным классам противогрибковых препаратов.
Для определения толерантности к противогрибковым препаратам клинические анализы не разработаны. Количественное измерение толерантности инфицирующих изолятов может дать прогностическую информацию относительно успеха моно- и комбинированной противогрибковой терапии. Методы микроразведений в бульоне и дисковой диффузии в сочетании с программой анализа изображений diskimageR были успешно использованы для количественной оценки толерантности к противогрибковым препаратам в исследовательских лабораториях.
Большинство клинических диагностических тестов проводятся на культурах, выращенных в течение 24 часов, и поэтому не могут выявить толерантные к лекарственным препаратам клетки, которые обычно визуально видны после 48 часов роста. Толерантность, наряду с факторами хозяина, иммунным статусом и фармакологическими особенностями, может объяснить, почему некоторые пациенты не отвечают на лекарственную терапию, несмотря на то, что инфицированы грибками, которые традиционными методами тестирования на чувствительность к антимикробным препаратам были определены как чувствительные к определенному препарату (т.е. клетки, рост которых не превышает МИК в течение 24 ч, стандартной конечной точки измерения МИК для видов Candida). "Трейлинг-рост" (клинический термин " толерантности") приводит к плохой реакции на флуконазол у C. tropicalis в личинках восковой моли и мышиных моделях, а высокий уровень толерантности связан с инфекциями C. albicans у пациентов, получающих лечение флуконазолом.
Адъювантные препараты способны поддерживать функции антимикробных препаратов. Было показано, что неантигрибковые средства повышают эффективность азоловых препаратов против резистентных видов Candida и других патогенных грибков, включая Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans и диморфный грибок Histoplasma capsulatum. В частности, противомалярийный препарат хлорохин в сочетании с флуконазолом проявил повышенную противогрибковую активность против изолятов C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis и C. krusei (телеоморфа известна как Issatchenkia orientalis и Pichia kudriavzevii) in vitro. Можно ли устранить толерантность и резистентность к азолам или другим классам противогрибковых препаратов у C. auris с помощью адъювантной противогрибковой терапии, еще предстоит изучить.
В другом исследовании изучалась активность доксициклина, пирвиния памоата, а также хлорохина в качестве адъювантов в комбинации с флуконазолом на клинических изолятах C. albicans, и было обнаружено повышение противогрибковой активности. Хлорохин является членом семейства хинолинов и используется для лечения таких заболеваний, как малярия, амебиаз, ревматоидный артрит, дискоидная и системная красная волчанка. Хлорохин вызывает истощение запасов железа, что приводит к снижению доступности мембранных стеролов и снижению регуляции гена ERG11. Мы предполагаем, что сочетание хлорохина с обычными противогрибковыми препаратами устранит толерантность к противогрибковым препаратам у C. auris.
Основные цели нашего исследования заключались в том, чтобы с помощью методов микроразведений в бульоне и дисковой диффузии вместе с программой diskImageR выяснить, возникает ли у C. auris толерантность ко всем трем классам противогрибковых препаратов и можно ли устранить эту толерантность с помощью адъювантной противогрибковой терапии.
Мы впервые сообщаем, что некоторые клинические изоляты C. auris толерантны к фунгистатическим (флуконазол, вориконазол, итраконазол и позаконазол) и фунгицидным (амфотерицин В и каспофунгин) препаратам. Мы также обнаружили толерантность к азолам у C. parapsilosis (флуконазол и вориконазол), но не у I. orientalis, который был внутренне резистентен к флуконазолу. Мы смогли обнаружить толерантность через 24 ч, а также через 48 ч после проведения противогрибковой терапии с помощью программ diskImageR и ImageJ.
Эти результаты свидетельствуют о том, что отдельные субпопуляции среди C. auris способны выживать и медленно расти в присутствии различных противогрибковых препаратов. Поскольку C. auris является патогеном с множественной лекарственной резистентностью, наличие толерантности еще больше сужает возможности терапии. Предыдущие отчеты показывают, что толерантные субпопуляции среди инфицирующих видов Candida сильно ассоциированы со смертностью среди пациентов с кандидемией. Поэтому клинико-диагностические лаборатории должны проводить анализ на толерантность к противогрибковым препаратам наряду со стандартными тестами на чувствительность/резистентность к противогрибковым препаратам, чтобы повысить эффективность противогрибкового лечения. Кроме того, существующие методы количественного определения толерантности могут быть адаптированы для определения толерантности через 24 ч и 48 ч, чтобы расширить сферу применения стандартных тестов на чувствительность к антимикотикам в диагностических лабораториях. Толерантность к флуконазолу, которую мы наблюдали у C. auris, согласуется с результатами предыдущих исследований C. albicans и C. auris, а также с результатами соответствующих клинических исследований "трейлинг-роста" (сниженный, но сохраняющийся видимый рост видов Candida в концентрациях флуконазола выше МИК).
Толерантность к фунгистатическим и фунгицидным препаратам, наблюдаемая у некоторых клинических изолятов C. auris в нашем исследовании, по-видимому, является обратимым явлением, как это было описано ранее для клинических изолятов C. albicans. Толерантные клетки, растущие внутри зон ингибирования после субкультуры, неотличимы от родительской популяции, что свидетельствует о наличии фенотипической гетерогенности, а не генетической вариации. Изоляты C. auris, культивированные внутри и вне зон ингибирования, не показали значительных изменений в средних размерах зон ингибирования, МИК или супра-МИК.
Эта обратимая толерантность, которую мы наблюдали у C. auris, может быть результатом стохастического переключения фенотипа или индуцированного ответа, активированного присутствием противогрибковых препаратов внутри клетки. Общий механизм, лежащий в основе толерантности у C. auris, еще предстоит выяснить в будущих работах, чему будут способствовать, например, математическое моделирование и синтетическая биология, отслеживание траекторий роста отдельных клеток и экспрессии генов в микрофлюидных устройствах, а также анализ генетической последовательности и анеуплоидии.
Толерантность у некоторых из наших изолятов C. auris была снижена или устранена in vitro путем комбинирования азольных, полиеновых и эхинокандиновых противогрибковых препаратов с противомалярийным препаратом хлорохином. Хлорохин снижал толерантность к некоторым комбинациям изолятов C. auris и противогрибковых препаратов, в то время как для других комбинаций хлорохин не оказывал адъювантного эффекта. Механизм, лежащий в основе этого зависящего от штамма явления, еще предстоит выяснить. Сочетание хлорохина с противогрибковыми препаратами оказало частичное влияние на резистентность некоторых изолятов C. auris, исследованных в данной работе.
В частности, изолят C. auris, который был устойчив к каспофунгину и вориконазолу, имел небольшое увеличение зоны ингибирования в присутствии хлорохина. Соответственно, изолят C. auris не имел зоны ингибирования для каспофунгина, но имел небольшую зону ингибирования в присутствии хлорохина. Зоны ингибирования в этих случаях были меньше, чем у чувствительных изолятов C. auris в наших экспериментах. Хлорохин не влиял на МИК изолятов C. auris в нашем исследовании. Хлорохин также повлиял на резистентность к флуконазолу у I. orientalis, хотя толерантные субпопуляции C. parapsilosis не были затронуты хлорохином.
В целом, эти результаты позволяют предположить, что сочетание хлорохина с противогрибковыми препаратами может оказывать частичное смягчающее воздействие на резистентность C. auris. Хотя механизм действия неизвестен, он, вероятно, связан с истощением запасов железа, вызываемым хлорохином, и его даунрегуляцией гена ERG11. Известно, что истощение железа снижает уровень мембранных стеролов и увеличивает проницаемость мембраны, что приводит к увеличению поглощения противогрибковых препаратов в клетке. Также известно, что ген ERG11, синтезирующий фермент ланостерол альфа деметилазы, является важным лимитирующим ферментом для синтеза эргостерола.
В данном исследовании нам удалось изучить ограниченное количество изолятов C. auris, тем не менее, представленные результаты, служат доказательством концепции, что C. auris толерантен к фунгистатическим и фунгицидным препаратам, и что эта противогрибковая толерантность может быть ослаблена при использовании хлорохина в качестве адъюванта. Дальнейшее подтверждение этих результатов in vitro на дополнительных изолятах C. auris, а также последующие исследования с использованием модельных систем in vivo будут продолжены. Еще одним ограничением нашего исследования является то, что мы не имели доступа к информации о пациентах и истории противогрибкового лечения из-за требований конфиденциальности.
В целом, данное исследование улучшает наше понимание неудачи противогрибкового лечения при инфекциях C. auris и определяет возможности для клинического выявления толерантности к противогрибковым препаратам, а также для разработки целевой адъювантной противогрибковой терапии против толерантного и резистентного инвазивного кандидоза.
