Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН предложили удобный маркер, позволяющий отслеживать генетические конструкции в штаммах винных дрожжей. Этим маркером стал ген аргиназы CAR1, при нарушении которого дрожжи теряют способность использовать в качестве источника азота аминокислоту аргинин.
Поэтому, если заменить ген CAR1 на любую представляющую интерес генную конструкцию, то можно легко выявить колонии, у которых вставка прошла успешно. При этом важно заметить, что удаление гена CAR1 улучшает свойства вина, поскольку аргиназа преобразует аргинин, обильно присутствующий в сусле, в мочевину, которая затем, взаимодействуя со спиртом, превращается в канцерогенное вещество этилкарбамат. Кроме того, в штаммах без гена CAR1 этот ген может быть использован в качестве плазмидного маркера для дальнейших генетических манипуляций. Результаты исследования опубликованы в журнале Journal of Microbiology Methods. Исследование выполнено в рамках проекта федеральной научно-технической программы развития генетических технологий и поддержано национальным проектом «Наука и университеты».
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, можно сказать, создают вино, сбраживая виноградное сусло. Изменяя некоторые гены дрожжей, можно улучшить качества вина. Но генетические манипуляции требуют использования маркеров – фенотипов, позволяющих отобрать и/или подтвердить желаемое генное изменение. Дело в том, что в процедурах генетической трансформации новая ДНК попадает не в каждую клетку, а лишь в одну из тысяч. Модифицированные клетки надо отбирать, и для этого к целевой ДНК добавляют маркер, дополнительную ДНК, придающую селектируемый фенотип. Так, лабораторные штаммы дрожжей обычно маркированы нарушением тех или иных генов биосинтеза аминокислот или нуклеотидов. Целевая ДНК, вводимая в дрожжи, должна содержать один из таких генов. Клетки, получившие такую ДНК, приобретают способность расти на среде, где отсутствует соответствующая аминокислота или нуклеотид. Это позволяет отделить небольшую долю клеток, принявших ДНК, от большинства клеток, куда ДНК не попала.
Однако у промышленных штаммов, и, в частности, винодельческих, генных нарушений нет, и они, как правило, нежелательны. Одним из немногих исключений является ген CAR1, поскольку его делеция снижает содержание в вине мочевины, которая, реагируя со спиртом, превращается в канцерогенный этилкарбамат. При этом ген CAR1 имеет легко наблюдаемое проявление: клетки без CAR1 не могут расти на среде, где единственным источником азота является аргинин.
Опираясь на этот фенотип, ученые ФИЦ Биотехнологии РАН предложили и опробовали несколько способов использования гена CAR1. Во-первых, локус CAR1 удобно использовать для интеграции в хромосому желаемых генных конструкций вместо CAR1. В этом случае клетки с требуемым изменением ДНК можно отличить по неспособности расти на среде с аргинином в качестве источника азота. При этом возникает дополнительное удобство. В таком штамме ген CAR1 можно использовать в качестве плазмидного маркера для дальнейших манипуляций. В работе было показано, что клетки, получившие плазмиду с геном CAR1, можно отбирать на среде с аргинином - источником азота. Таким образом, ученые в этой работе продемонстрировали принцип, использование гена CAR1 как маркера.
Но о каких же плазмидах идет речь, учитывая, что ген CAR1 не полезен для вина? Это плазмиды типа «сделал дело и уходи» - плазмиды системы CRISPR/Cas9. Они кодируют нуклеазу Cas9 и гидовую РНК, которая точно указывает Cas9, в каком месте разрезать хромосому. Одновременно с плазмидой CRISPR/Cas9 в клетку вводят «заплатку», фрагмент ДНК, который залечивает разрыв путем рекомбинации гомологичных концевых участков ДНК. Эта ДНК может определять любое изменение редактируемого локуса, например, вставку любых нужных для исследования генов. Плазмида же с CRISPR/Cas9 и геном CAR1 спонтанно теряется в поколениях клеток дрожжей, как только их начинают растить на богатой неселективной среде.
Чтобы подтвердить, что у штамма дрожжей, подвергшегося геномному редактированию, действительно не работает ген CAR1, авторы поместили его на чашки Петри со средой, единственным источником азота в которой был аргинин. Эксперимент показал, что клетки Saccharomyces cerevisiae действительно не были способны расти в таких условиях. Любопытно, что, при выращивании на среде с более привычными для дрожжей источниками азота, помимо аргинина, «отредактированные» колонии внешне отличались от исходного штамма. Так, колонии, содержащие CAR1, по форме напоминали звезды, а те, у которых этот ген был заблокирован, имели вид правильных гладких кругов.
Дополнительное подтверждения того, что удалось «выключить» ген CAR1, показала полимеразная цепная реакция (ПЦР), а также полногеномное секвенирование, то есть расшифровка всего генома дрожжей.
Помимо того, что «выключение» гена CAR1 может служить удобным генетическим маркером, оно также будет способствовать улучшению качества вина, поскольку кодируемая им аргиназа приводит к накоплению в вине мочевины, которая, в свою очередь, может вступать в реакцию с винным этанолом и образовывать этилкарбамат — канцерогенное соединение. Когда же ген CAR1 не работает, это вещество не накапливается.
«Поскольку делеция CAR1 благоприятна для свойств вина, и она может длительно сохраняться в штаммах винных дрожжей, ее можно использовать в качестве удобного сайта для встраивания различных генетических конструкций. Она будет одновременно служить надежным генетическим маркером и препятствовать накоплению опасного канцерогена в вине», — рассказывает Виталий Кушниров, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной генетики ФИЦ Биотехнологии РАН.
