Редактирование генов и многие другие полезные биотехнологические инструменты появились благодаря исследованиям бактерий, сражающихся с вирусными захватчиками. Но ученые только начали раскрывать секреты этой древней гонки вооружений.
По всему миру - в океанах, в почве, в нашем теле - идет невидимая битва. Огромная популяция, состоящая примерно из 1030 бактерий нашей планеты, сталкивается с непрекращающимся натиском еще более многочисленной армии бактериофагов. Бактерии имеют в своем распоряжении множество средств защиты: они измельчают вирусные компоненты, лишают захватчиков ключевых ингредиентов для репликации и даже отключают собственные биологические системы, чтобы остановить инфекцию, жертвуя собой ради защиты ближайших сородичей. Вирусы, в свою очередь, развивают механизмы контрзащиты, что приводит к постоянно обостряющейся гонке вооружений.
Хотя микробиологи только начинают понимать масштабы этого вечного соревнования, иммунные механизмы микроорганизмов уже вдохновили их на технологии, которые произвели революцию в биологии. Открытие ферментов рестрикции - бактериальных белков, которые разрезают ДНК на определенные участки, - дало толчок развитию молекулярной биологии в 1970-х годах, что позволило сделать все возможное - от создания генетически модифицированных организмов до ДНК-криминалистики. CRISPR-Cas, бактериальная защитная система, которая распознает и разрезает определенные последовательности в вирусных геномах, дала ученым возможность удалять или редактировать гены с поразительной точностью. Разработанная в начале 2010-х годов система редактирования генов на основе CRISPR привлекла миллиардные инвестиции и принесла ее ключевым первооткрывателям Нобелевскую премию по химии 2020 года.
CRISPR-Cas и другие открытия вызвали взрыв интереса и открытий в области систем защиты микроорганизмов. Благодаря достижениям в области вычислительной биологии и геномного секвенирования ученые выявили множество иммунных механизмов, которые бактерии и другая прокариотическая форма жизни на Земле, археи, используют в своей постоянной борьбе с вирусами. «Я бы сказал, что бактерии и археи используют для защиты все, что только можно себе представить, - и еще кое-что, чего нельзя», - говорит Юджин Кунин, эволюционный биолог из Национальной медицинской библиотеки США.
Эти открытия уже привели к усовершенствованию редактирования генов и других технологий. Некоторые из этих защитных механизмов имеют родственников в нашей иммунной системе и хотя ни одна технология, похоже, не способна превзойти CRISPR-Cas как одно из самых революционных биологических открытий века, ажиотаж ощущается. «Сделать лучше, чем CRISPR, - это очень сложная задача», - утверждает Кунин, но «есть некоторые из этих систем, которые могут найти очень широкое применение».
Хотя бактерии, археи и их фаги соперничают друг с другом миллиарды лет, микробиологи не обращали внимания на паноптикум защитных систем до последнего десятилетия. Отчасти это объясняется тем, что не было простого способа их обнаружения, отмечает Ротем Сорек, микробиолог из Научного института Вейцмана (Израиль). Ситуация изменилась в 2011 году, когда Кунин, эволюционный биолог Кира Макарова и их коллеги показали, что гены иммунитета в геноме микроорганизмов имеют тенденцию группироваться в «защитные острова». Это открытие означало, что ученые могут использовать известные защитные гены для поиска вероятных подозреваемых поблизости.
Кандидаты вскоре начали появляться. В последующие годы группа Сорека и другие исследователи сообщили о сотнях потенциальных защитных генов. Большинство исследований до сих пор было сосредоточено на бактериях, для которых у ученых есть достаточно инструментов для работы с генами. Чтобы проверить защитную систему, ученые могут выбрать кандидата, вставить гены в стандартный штамм лабораторных бактерий и проверить, позволяют ли они микробам противостоять фагам, от которых они не могли защититься раньше. Открытия происходят быстро, рассказывает Артем Исаев, микробный иммунолог из Центра молекулярной и клеточной биологии в Москве. «Сейчас мы обсуждаем по пять работ в неделю и не успеваем обсудить все».
В ходе исследований были обнаружены удивительные иммунные механизмы, например, тот, с которым столкнулся биохимик Филипп Кранзуш, когда был постдокторантом в лаборатории Дженнифер Дудны в Калифорнийском университете. Кранзуш не был микробиологом: он изучал вирусологию человека, но в начале 2010-х годов он заинтересовался иммунным белком человека под названием cGAS. Он обнаруживает чужеродную ДНК и вырабатывает сигнальную молекулу, которая запускает часть иммунной системы, известную как интерфероновый ответ. Бактерии содержат ферменты, вырабатывающие аналогичную сигнальную молекулу, поэтому Кранзуш задался вопросом, сможет ли изучение этих ферментов дать представление о функции cGAS. Примечательно, что бактериальные белки имели очень похожую структуру с cGAS. «Я помню, как вбежал в кабинет Дженнифер и воскликнул», - вспоминает Кранзуш. «Тот же механизм, что и в клетках человека, есть и в бактериях!».
Кранзуш продолжал исследовать эту систему, а Сорек также изучал бактериальный аналог cGAS, называемый CBASS. Их группы показали, что CBASS - это полноценная система защиты микроорганизмов, которая даже использует тот же рецептор сигнальных молекул, называемый STING, что и иммунная система человека. Кранзуш и Сорек также открыли бактериальный аналог эукариотических иммунных белков, называемых газдерминами, которые создают поры в клеточной мембране, чтобы убивать инфицированные клетки и блокировать вирусную репликацию. А микробиолог Ауде Бернхейм и ее коллеги описали прокариотические версии эукариотических вайперинов: эти белки производят молекулы, которые останавливают транскрипцию вирусных генов в РНК. Группа Сорека также описала микробный иммунный механизм под названием Thoeris, который имеет много общего с защитными механизмами растений. "С эволюционной точки зрения это очень неожиданно, - говорит Бернхейм. Ученые предполагали, что иммунные системы будут быстро развиваться перед лицом непрекращающихся вирусных атак, что приведет к огромному расхождению между прокариотическими и эукариотическими защитными механизмами.
Вместо этого, по крайней мере в некоторых случаях, система, возникшая у предшественников прокариот и эукариот, сохранялась на протяжении миллиардов лет эволюции, создавая параллельную биологию у микробов и человека или растений.
Теперь биотехнологи адаптируют эти древние инновации в лабораторные или клинические методы. На базовом уровне они могут защитить ценные культуры микроорганизмов, говорит Оуэн Тук, аспирант из лаборатории Дудны, который работает над защитной системой, разрушающей ДНК, под названием Hachiman. Например, если биореактор будет инфицирован фагами, ученые смогут активировать защитные механизмы в бактериях, чтобы уничтожить чужаков, поясняет Тук.
Исследователи также создают индивидуальные инструменты. Например, система Argonaute (Аргонавт) - иммунная реакция, первоначально обнаруженная у эукариот - сначала у растений, затем у животных. Она использует малые РНК-проводники, чтобы направлять другие РНК, например вирусные, на уничтожение. У микробов система аргонавтов работает более вариативно, отмечает Даан Свартс, биохимик из Вагенингенского университета и исследовательского центра в Нидерландах. По его мнению, датчики аргонавтов могут замечать свободные концы ДНК или избыток циркулярных молекул ДНК. В ответ на инфекцию механизмы, связанные с Argonaute, могут повредить гены патогена или лишить клетку важнейших метаболитов, таких как NAD+ и NADP+, которые участвуют в производстве энергии и других процессах.
Исследователи использовали микробных аргонавтов для редактирования бактериальных геномов и вырезания точных последовательностей ДНК. В экспериментах по поиску специфических, редких последовательностей ученые также использовали аргонавтов для удаления распространенных, но нежелательных последовательностей, чтобы редкие было легче обнаружить. А Свартс и его коллеги разработали диагностику для выявления интересующих последовательностей. Для этого они адаптировали систему разрушения NAD+/NADP+, названную SPARTA, и создали тест, который меняет цвет или флуоресцирует после захвата целевой последовательности. «В принципе, с помощью этих аргонавтов можно обнаружить любой тип последовательности», - говорит Свартс. «Мы пока не сталкивались с какими-либо ограничениями».
Многие из этих задач может выполнять CRISPR-Cas, но у аргонавтов есть и другие возможности. Обеим системам требуется направляющая РНК для поиска целевых последовательностей, но ферменту Cas также необходим дополнительный фрагмент последовательности, называемый PAM, который помогает Cas связываться с двойной спиралью ДНК и разворачивать ее. Argonaute работает без PAM, а последовательность направляющей РНК может быть короче, что делает систему более простой в производстве. Кроме того, отмечает Свартс, подать патентную заявку на Argonaute проще, чем получить патенты на идеи в насыщенной области CRISPR-Cas.
Фэн Чжан, молекулярный биолог из Массачусетского технологического института, открыл еще одну эффективную CRISPR-подобную систему. Он и его коллеги искали молекулы с генетическими последовательностями и белковыми структурами, похожими на CRISPR-Cas, и нашли ДНК-связывающую систему, которую они назвали TIGR-Tas (tandem interspaced guide RNA-TIGR-associated protein). Как и CRISPR, эта система состоит из двух частей, которые обнаруживают определенные последовательности ДНК и могут быть запрограммированы на разрезание в нужных местах. Но TIGR-Tas не требует PAM, а ее компоненты физически меньше, чем у CRISPR, что может быть полезно в таких областях, как генная терапия, когда в ткани может быть доставлено лишь ограниченное количество молекулярного груза.
Еще одна бактериальная защитная система, готовая к инновациям, включает генетические элементы, называемые ретронами. Они были обнаружены в 1980-х годах, когда ученые заметили сотни копий коротких одноцепочечных ДНК в образцах почвенной бактерии Myxococcus xanthus. Они определили, что эти одноцепочечные ДНК были произведены ферментом обратной транскриптазы, который создает ДНК из шаблона РНК, и этот тип системы стал известен как ретрон. Сет Шипман, биоинженер из Калифорнийского университета, наткнулся на ретроны в научной литературе в начале 2010-х годов, когда искал способ производства определенных последовательностей ДНК в клетках. «Они были просто идеальным инструментом», - вспоминает он.
Компоненты иммунной системы бактерий могут быть использованы для изменения генов других организмов, например дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Фото: Michael Short/Gladstone Institutes
Лишь в 2020 году Сорек и другие исследователи сообщили, что ретроны действительно участвуют в иммунитете микроорганизмов. Они относятся к общей категории защитных систем, известных как токсин-антитоксиновые системы, в которой противовирусный токсин - который может варьироваться от системы к системе - остается в клетке с соответствующим антитоксином до тех пор, пока не будет обнаружен захватчик. Для ретронов токсином может быть любое количество белков, вызывающих смертельную реакцию, например деградацию ДНК. Антитоксин состоит из РНК-шаблона, все еще связанного с одноцепочечным продуктом ДНК. Эта ДНК сворачивается в двойную спираль и служит пусковым механизмом клетки. Если фермент фага пытается модифицировать ДНК, это приводит к структурным изменениям, которые высвобождают токсин.
По мнению Шипмана, ретроны - удобное дополнение для редактирования генов CRISPR-Cas. Одна из проблем редактирования - доставка большого количества ДНК, которая служит шаблоном для нужной модификации. С помощью ретронов и их ферментов обратной транскрипции Шипман может сконструировать клетки так, чтобы они сами производили множество копий шаблона. Он редактировал таким образом бактерии, дрожжи, человеческие клетки и бактериофаги и стал одним из основателей компании, которая находится на ранних стадиях развития этой технологии.
Ученые также могут обратиться к самим фагам, чтобы найти интересные инструменты. "Фаги, конечно, сопротивляются, - говорит Тук. Вирусные средства защиты, такие как анти-CBASS или анти-CRISPR белки, могут прилипать к фаговым сенсорам микробов, уничтожать или поглощать молекулы защитных сигналов. По мнению микробиолога Джозефа Бонди-Деноми из Калифорнийского университета, анти-CRISPR можно использовать для тонкой настройки редактирования CRISPR-Cas. Он наткнулся на анти-CRISPR в 2011 году, будучи аспирантом Университета Торонто в Канаде, когда заметил, как фаг отключает защиту бактерии-хозяина Pseudomonas aeruginosa. В настоящее время известно более 100 семейств антиCRISPR-белков с различными механизмами действия. Некоторые из них, например, прилипают к белку Cas и блокируют его связывание или разрезание фаговой ДНК; другие модифицируют или расщепляют РНК-проводник.
Существует множество причин, по которым ученым может понадобиться переключатель "вкл.\выкл." CRISPR. Например, фермент Cas часто разрезает не только целевой сайт, но и аналогичные внецелевые сайты. Редактирование по цели происходит быстрее и эффективнее всего, поэтому, используя ослабленный анти-CRISPR или задерживая его активность, ученые смогут предотвратить большинство нежелательных правок, в то время как запланированные изменения будут продолжаться. Стартап Бонди-Деноми, компания Acrigen Biosciences (США), разрабатывает этот подход для генной терапии.
Механизмы бактериального иммунитета и противодействия вирусам, вероятно, найдут применение и в медицине, например, при разработке антибиотиков. Это связано с тем, что многие из этих защитных систем имеют характер самоуничтожения: микроб блокирует свои собственные важные процессы, такие как репликация генома или метаболизм, чтобы помешать вирусному захватчику. Системы микробной защиты, включая CBASS, газдермины, ретроны и другие токсины-антитоксины, могут задействовать процессы, повреждающие клетку-хозяина, и теоретически могут быть активированы или доставлены для борьбы с микробными инфекциями.
«По сути, они представляют собой золотую жилу антибактериальных ферментов»,
- говорит Бонди-Деноми. Загвоздка, добавляет он, в том, что все эти системы эволюционировали, чтобы работать внутри клетки. Это означает, что потенциальное средство должно преодолеть клеточную стенку и плазматическую мембрану, чтобы обеспечить работу таких систем-убийц, или активировать уже имеющиеся.
Один из вариантов заключается в том, что биоинженерные фаги могут доставлять антимикробные системы. Например, компания Locus Biosciences (США), разработала фаги, которые несут в себе антимикробную систему CRISPR. Вместо того чтобы бороться с вирусами, эта CRISPR заставляет бактерии уничтожать собственные гены. В ходе небольшого испытания такой терапии на женщинах с инфекциями мочевыводящих путей лечение позволило снизить уровень патогенов и устранить симптомы.
Работа над изучением защитных систем микроорганизмов может иметь последствия и для фаговой терапии. «Как только мы начнем применять фаговую терапию, мы столкнемся с резистентностью к фагам», - предупреждает Асма Хатум-Аслан, микробиолог из Иллинойского университета. «Просто нужно знать об этом заранее и предусмотреть в наших фаговых терапиях некоторые меры». Помимо этого, отмечает Бернхайм, исследования систем, которые отражают иммунитет человека, указывают на потенциальные способы лечения аутоиммунных заболеваний, рака или инфекций. Например, молекулы, подавляющие транскрипцию, производимые прокариотическими вайперинами, можно превратить в противовирусные препараты. Или, как полагает Кранзуш, сигнальные молекулы, производимые системами CBASS, могут быть адаптированы для создания адъювантов - иммуностимулирующих молекул, которые усиливают реакцию организма на вакцины. А в прошлом году Бонди-Деноми и его коллеги описали использование анти-CBASS белка для глушения cGAS-STING в клетках человека, что может создать противовоспалительный эффект. Бернхейм и другие микробиологи налаживают партнерские отношения с учеными, занимающимися иммунитетом человека, чтобы продолжить работу в этом направлении.
Тем временем она и другие ученые продолжают поиск систем-кандидатов. Например, как описано в недавнем препринте, лаборатория Бернхейм и группа Майкла Лауба, микробиолога из Массачусетского технологического института, использовали машинное обучение для выявления множества кандидатов в защитники. "Буквально тысячи новых систем еще предстоит открыть, - утверждает Лауб.
