Системы CRISPR-Cas могут быть использованы в качестве антимикробных препаратов с программируемым спектром действия для борьбы с бактериальными инфекциями.
Однако вопрос о том, как нуклеазы CRISPR действуют в качестве антимикробных препаратов на разных объектах-мишенях и штаммах, остается малоизученным.
Среди новых антимикробных стратегий системы CRISPR-Cas стали перспективным средством для специфического устранения бактериальных патогенов из микробного сообщества, не затрагивая окружающие бактерии. Это свойство является преимуществом по сравнению с антибиотиками, которые обычно убивают множество бактерий без разбора, тем самым изменяя микробиом человека и способствуя колонизации патогенными бактериями.
Программируемость систем CRISPR-Cas также дает преимущества перед литическими бактериофагами, которые не могут быть легко адаптированы к геномной последовательности бактерий-мишеней. Специфичность CRISPR-Cas систем обусловлена их естественной ролью в качестве адаптивных иммунных систем. Эти системы хранят патогенные последовательности (так называемые спейсеры), фланкированные палиндромными повторяющимися последовательностями в массиве CRISPR. При заражении массив обрабатывается для создания активной направляющей РНК (gRNA), состоящей из усеченного спейсера и повторяющейся последовательности. Эта gRNA направляет нуклеазу Cas на распознавание определенной последовательности ДНК или РНК, вызывая тем самым иммунный ответ.
Существует огромное количество CRISPR-Cas систем, которые делятся на два класса, семь типов и более 33 подтипов и вариантов. Каждый класс включает в себя мультибелковый эффекторный комплекс (класс I) или одноэффекторную нуклеазу (класс II) для иммунной защиты. Тип обычно определяется по конкретному эффектору (например, Cas9 для систем типа II), в то время как подтип отражает различные вспомогательные cas-гены или различные филогении эффектора. Некоторые системы действуют на ДНК (тип I, II и большинство типов V), другие на РНК и обладают сопутствующей активностью (тип III и VI), представляя собой широкий спектр действий, которые могут быть использованы для различных целей.
В рамках разнообразия CRISPR-нуклеаз разработка антимикробных препаратов CRISPR была сосредоточена на нуклеазах Cas9 второго типа, которые вносят слепые разрезы в ДНК, нуклеазах Cas13 шестого типа, которые приводят клетки в состояние покоя путем сопутствующей деградации РНК, и многосубъединичном комплексе Cascade первого типа, который рекрутирует Cas3 для захвата и деградации одной нити ДНК. Такие нуклеазы использовались либо для уничтожения плазмид, резистентных к антибиотикам, либо для избирательного уничтожения клеток путем нацеливания на хромосомную ДНК или клеточную РНК.
В большинстве исследований тестировался только один конкретный штамм бактерий и одна нуклеаза, при этом практически отсутствуют рекомендации по выбору нуклеазы или по разработке эффективных gRNA. Доставка также остается серьезной проблемой, и доставка нуклеаз и gRNA осуществляется в основном с помощью умеренных или литических фагов, конъюгированных плазмид или наночастиц на основе полимеров и липидов. На сегодняшний день фаги используются наиболее широко, а спектр бактерий, которые они могут инфицировать, был расширен за счет инженерии белков хвостового волокна для повышения их эффективности для нескольких штаммов. Эти достижения создают основу для изучения того, как эффективно разрабатывать и применять CRISPR-антимикробные препараты, особенно в отношении клинически значимых патогенов, для которых необходимы новые антимикробные средства.
Мы попытались сделать следующий шаг, используя в качестве исследования клинически значимые штаммы Klebsiella pneumoniae. Для изучения особенностей, которые могут улучшить нацеливание на разные штаммы, мы провели геномный скрининг в разных штаммах K. pneumoniae, который позволил выявить правила дизайна направляющих и обучить алгоритм прогнозирования эффективности направляющих. Мы также показали, что антимикробные препараты Cas12a могут быть использованы для уничтожения K. pneumoniae, если они закодированы в фагемидах (фагемида — это вектор для клонирования на основе ДНК, который обладает как бактериофагными, так и плазмидными свойствами - прим.ред.).
В целом, наши результаты подчеркивают важность оценки антимикробной активности CRISPR-антимикробных препаратов на соответствующих штаммах и определяют критические параметры для эффективного таргетинга на основе CRISPR.
