Протозойные организмы, относящиеся к роду Leishmania, являются паразитами ретикулоэндотелиальной системы млекопитающих.
В зависимости от вида паразиты Leishmania вызывают три различных клинических проявления - кожный (КЛ), мукозальный (МЛ) и висцеральный лейшманиоз (ВЛ). По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется около 1 200 000 случаев КЛ и 700 000 случаев ВЛ. ВЛ является наиболее тяжелой клинической формой, которая при отсутствии лечения часто приводит к смерти и сопровождается гепато-спленомегалией, анемией, фиброзом и дизэритропоэзом в костном мозге.
Лишь небольшая часть инфекций приводит к симптоматическому ВЛ у человека, большинство же остаются бессимптомными носителями. Было показано, что иммунологические механизмы, в которых доминирует Th1-поляризованный ответ, характеризующийся действием провоспалительных цитокинов интерферона γ (IFN-γ), интерлейкина-12 (IL-12) и фактора некроза опухоли (TNF), очищают организм от паразитов при бессимптомном ВЛ, однако бессимптомные инфекции L. donovani и пост-кала-азарный кожный лейшманиоз интенсивно изучаются, поскольку считается, что они способствуют передаче заболевания.
Поэтому возникает вопрос, каковы резервуары паразита в клетках хозяина при хронических инфекциях? Сложное взаимодействие факторов хозяина и паразита, определяющих патофизиологию, клиническую вариабельность, восприимчивость/резистентность и хроническую форму заболевания, интенсивно изучается для достижения целей контроля и ликвидации ВЛ.
Появление высокопроизводительных методов, таких как секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq), в сочетании с новым вычислительным анализом позволило исследовать такие разнообразные проблемы, как кроветворение, эмбриональное развитие, и создание атласов единичных клеток для различных видов рака. Аналогичные методы были применены для изучения паразитарных заболеваний с точки зрения трехстороннего взаимодействия между клетками хозяина, паразитами и переносчиками.
Применение анализа scRNA-seq выявило скрытое разнообразие транскрипционных сигнатур на различных жизненных стадиях паразитов Plasmodium, связанных с патогенностью, половой приверженностью, асинхронным развитием и созреванием спорозоитов. Эпигеномика одиночных клеток и scRNA-seq отслеживали динамику развития Th1 и T фолликулярных хелперов (Tfh) клеток, влияющих на возникновение CD4+ T клеток памяти при малярии. Конвергентный транскрипционный профиль в атипичных В-клетках был выявлен при малярии, ВИЧ и аутоиммунных заболеваниях. В результате комплексного функционально-геномного анализа с помощью scRNA-seq различных видов паразитов Plasmodium и инфицированных паразитами клеток был создан интерактивный атлас клеток малярии, который был назван "дорожной картой" для исследований малярии.
По аналогии с исследованиями паразитов Plasmodium, scRNA-seq применялась для отслеживания генетических гибридов Leishmania после воздействия стресса, связанного с повреждением ДНК, что повысило эффективность гибридизации in vitro L. tropica, L. donovani, L. infantum и L. braziliensis, способной генерировать внутри- и межвидовые гибриды. В многочисленных исследованиях с различными видами Leishmania применялись методы объемного РНК-секвенирования для анализа лекарственной устойчивости , РНК-интерактома , взаимодействия хозяина и паразита , а также для характеристики стадий развития L. major в песчаных мухах.
Анализ Dual-RNA-seq, направленный на изучение транскриптомов хозяина и паразита с помощью объемного RNA-seq в печени и селезенке мышей, инфицированных L. donovani и L. infantum, показал потенциальные различия в патофизиологии этих двух инфекций. Транскрипционный анализ с использованием деконволюции клеточных типов in silico выявил сигнатуру экспрессии генов, которая сохранилась в когортах ВЛ в Индии, Эфиопии и Бразилии. scRNA-seq клеток, выделенных из мышей, инфицированных L. major, выявил гетерогенные популяции рекрутов и обитателей кожи.
Создание атласа лейшманий по аналогии с атласом клеток малярии способствовало бы беспрецедентным исследованиям таких трудноразрешимых вопросов, как персистенция паразита, лекарственная резистентность, детерминанты защитного иммунитета и патогенез. Несмотря на быстрый прогресс в области вычислительных средств, методы scRNA-seq никогда не применялись для одновременного анализа транскриптов хозяина и паразита. Анализ транскриптов хозяина и паразита на уровне одной клетки позволил бы идентифицировать новые типы клеток за счет аннотации клеток с помощью транскриптомного анализа.
Традиционные методы, такие как проточная цитометрия, ограничены в применении, поскольку позволяют обнаружить только те клетки, для которых имеются маркеры. Для достижения этой цели мы описали новый метод двойного скрининга, позволяющий выявлять паразитирующие клетки в селезенке и костном мозге мышей, хронически инфицированных L. donovani, и анализировать транскриптомные сигнатуры паразитирующих и побочных клеток для получения глубоких представлений о патогенезе ВЛ. Такой метод может быть широко применен к другим паразитарным инфекциям, для которых имеются эталонные транскриптомы.
Хотя фагоцитирующие клетки являются документально подтвержденными мишенями для паразитов Leishmania, остается неясным, могут ли заражаться другие типы клеток. В данной работе мы использовали несмещенное секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) для одновременного анализа транскриптомов клеток хозяина и Leishmania donovani с целью выявления и аннотирования паразитирующих клеток в селезенке и костном мозге хронически инфицированных мышей.
Наша методология двойного скриптомного анализа позволила выявить гетерогенные паразитирующие популяции. В селезенке доминирующими паразитирующими клетками являются моноциты и макрофаги, в то время как неожиданно инфицированными были обнаружены мегакариоциты, базофилы и естественные клетки-киллеры (NK). В костном мозге основными паразитирующими клетками являются гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), экспрессирующие фагоцитарные рецепторы FcγR и CD93. Кроме того, у хронически инфицированных мышей мы обнаруживаем паразитирующие циклические базальные клетки, эозинофилы и макрофаги. Проточный цитометрический анализ подтверждает наличие паразитированных ГСК. Таким образом, наш метод позволил выявить редкие паразитирующие клетки, потенциально участвующие в патогенезе, персистенции и защитном иммунитете.
