Болезни пищевого происхождения оказывают повсеместное глобальное воздействие, затрагивая население всего мира.
По оценкам ВОЗ, ежегодно 600 миллионов человек страдают от пищевых инфекций, что приводит к смерти 420 000 человек, а употребление небезопасных продуктов питания ежегодно приводит к потере 33 миллионов лет здоровой жизни. Согласно докладу Всемирного банка за 2019 год, болезни пищевого происхождения оказывают существенное экономическое бремя на страны с низким и средним уровнем дохода, ежегодные расходы которых оцениваются примерно в 95,2 млрд долларов, включая потери производительности, а ежегодные расходы на лечение заболеваний пищевого происхождения оцениваются в 15 млрд долларов. Эти данные подчеркивают значительное финансовое воздействие болезней пищевого происхождения и указывают на настоятельную необходимость принятия эффективных мер профилактики и контроля.
Необходимость использования эффективных технологий для обнаружения пищевых патогенов необходимо для выявления и смягчения последствий потенциальных вспышек, улучшения мер безопасности пищевых продуктов и снижения заболеваемости пищевыми инфекциями. Поэтому разработка и внедрение передовых технологий для быстрого обнаружения патогенов имеют первостепенное значение.
В настоящее время для обнаружения патогенов существует множество методов. Традиционный метод, основанный на культивировании, хотя и широко используется, занимает много времени, является трудоемким и дорогостоящим, особенно в отношении прихотливых бактерий со строгими требованиями к культивированию. Чтобы преодолеть эти недостатки, необходимо быстрое, надежное, экономически эффективное и высокопроизводительное обнаружение патогенов в пищевых продуктах.
Технология MassARRAY является надежной и адаптируемой технологией, широко используемой в молекулярной биологии и генетике для высокопроизводительного генотипирования и выявления мутаций. Принцип технологии MassARRAY заключается в одновременной амплификации нескольких целевых последовательностей ДНК в одной реакции с образованием ампликонов. Затем эти ампликоны служат шаблонами для реакции удлинения одного нуклеотида, а полученные продукты с определенными молекулярными массами впоследствии анализируются с помощью масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией во времени (MALDI-TOF MS). Эта уникальная функция позволяет идентифицировать и анализировать целевые гены на основе их молекулярных масс, исключая необходимость в референсной базе данных. Данная технология обладает многочисленными преимуществами по сравнению с альтернативными платформами генотипирования. Ее исключительная гибкость и масштабируемость позволяют анализировать несколько или сотни генетических маркеров в рамках одного эксперимента.
За последнее десятилетие MassARRAY доказал свою эффективность в молекулярных исследованиях. Он отлично справляется с точным обнаружением тонких генетических вариаций, таких как однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs), и продемонстрировал эффективность в обнаружении раковых мутаций, особенно в выявлении мутаций рецептора эпидермального фактора роста в легочной ткани и цитологических образцах с высокой чувствительностью и специфичностью, по сравнению с другими методами. Кроме того, MassARRAY демонстрирует надежность в обнаружении патогенов, в частности для выявления специфических штаммов энтеровирусов человека. Он также был применен для выявления генов резистентности к противомикробным препаратам, показав превосходную чувствительность и специфичность по сравнению с традиционными методами. Недавно MassARRAY стал надежным методом для выявления и генотипирования патогенов в образцах COVID-19, а также доказал свою эффективность при идентификации и типировании различных вариантов SARS-CoV-2. Эти достижения подчеркнули значительный потенциал MassARRAY как ценного метода, показав многообещающие перспективы его применения в широком спектре обнаружения и генотипирования патогенов.
Целью данного исследования была разработка, валидация и оценка анализа на основе MassARRAY для обнаружения и идентификации значимых энтеропатогенных бактерий, включая Campylobacter coli, C. jejuni, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Shigella spp., Enterococcus faecalis, E. faecium, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. и Staphylococcus aureus. Выделив эти ключевые энтеропатогенные бактерии, авторы исследования попытались использовать потенциал MassARRAY для точного и эффективного обнаружения и идентификации. Это способствует расширению диагностических возможностей в области бактерий пищевого происхождения.
Методы: Анализ на основе MassARRAY был разработан для выявления 10 важнейших бактериальных патогенов пищевого происхождения, включая Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shigella spp. и Staphylococcus aureus. Анализ был оптимизирован с использованием эталонной gДНК (n = 19), после чего была проведена валидация с использованием gДНК (n = 85) эталонных и лабораторных изолятов (gДНК - геномная ДНК). Кроме того, была проведена оценка реакции анализа с использованием смеси gДНК всех целевых видов. Была проведена оценка валидации метода на полевых образцах путем сравнения его со стандартными методами микробиологического анализа, используемыми в повседневной практике.
Результаты: Разработанный метод анализа на основе MassARRAY продемонстрировал 100% совпадение с известными чистыми культурами бактерий. Метод с использованием смеси gДНК всех целевых видов показал способность MassARRAY обнаруживать все целевые виды в одном анализе с минимальной концентрацией 1 нг/мкл gДНК. Пределы обнаружения методики составляют от 357 ± 101 до 282 000 ± 79 196 клеток. Более того, валидация анализа на полевых образцах показала 100-процентную корреляцию между данными, полученными стандартным микробиологическим методом и анализом на основе MassARRAY.
Выводы: Таким образом, разработанный метод анализа на основе MassARRAY продемонстрировал высокую производительность при одновременной идентификации целевых видов в одном анализе с высокой специфичностью. Его успешное применение позволило сделать его оптимальным выбором для быстрого обнаружения бактериальных патогенов пищевого происхождения в реальных полевых условиях. Кроме того, экономичность, экономия времени и точность, присущие технологии MassARRAY, позволяют использовать ее в лабораториях пищевой промышленности, особенно в тех, которые занимаются контролем качества пищевых продуктов.
