Замысловатое взаимодействие экспрессии генов в живых клетках напоминает хорошо срежиссированную симфонию, в которой каждый ген играет свою роль в идеальной гармонии, обеспечивая нормальное функционирование клеток.
В центре этой симфонии находятся факторы транскрипции (ФТ) - молекулярные маэстро, регулирующие экспрессию генов путем связывания с определенными последовательностями ДНК, называемыми промоторами. Для раскрытия секретов этих регуляторных сетей генома необходимо собрать полный набор профилей экспрессии генов, однако измерение ответов на экспрессию генов для каждой пары ФТ и промотора представляет собой сложную задачу из-за огромного количества возможных комбинаций даже в таких относительно простых организмах, как бактерии.
Для решения этой проблемы исследователи под руководством Фучжуна Чжана, профессора кафедры энергетики, экологии и химической инженерии инженерного факультета Вашингтонского университета, разработали методику, получившую название секвенирования объединенных ответов промоторов на модификации ФТ (PPTP-seq). PPTP-seq объединяет редактирование генов CRISPR с комбинаторной библиотекой, содержащей все известные ФТ в геноме мишени и соответствующие промоторы. Эта новаторская методика позволяет ученым изучать регуляцию генов сотнями ФТ, действующих на тысячи промоторов, в рамках одного эксперимента, который занимает около двух недель и позволяет получить легко обрабатываемые данные.
В исследовании, опубликованном 16 сентября в журнале Nature Communications, лаборатория Чжана использовала PPTP-seq для систематического изучения активности 1 372 промоторов E. coli при воздействии на них каждого из 183 ФТ. Этот единственный эксперимент позволил получить представление о более чем 200 000 потенциальных взаимодействий между ФТ и промоторами, составить полную картину регуляторного ландшафта E. coli, выявить новые регуляторные реакции и заложить основу для будущих генетических исследований.
"Как инструмент синтетической биологии, PPTP-seq позволяет проводить высокопроизводительные исследования регуляции генов", - сообщил Чжан. "Наиболее часто используемый инструмент для изучения регуляции генов - РНК-секвенирование - позволяет выявить около 4 000 регуляторно-генных ответов. PPTP-seq увеличил это число в 50 раз, выявив 200 000 регуляторных генных ответов в одном эксперименте. Используя этот новый мощный инструмент, мы смогли представить всеобъемлющую регуляторную сеть E. coli в масштабе генома".
Кроме того, что PPTP-seq позволяет получить гораздо больше данных, он также дает возможность уловить сложные нюансы регуляции генов в различных клеточных контекстах. Подвергая E. coli воздействию различных ростовых сред, исследователи выявили сложную промоторную активность и регуляцию генов, что позволяет взглянуть на адаптивность этих микроорганизмов.
"Даже простые бактерии имеют более 4 000 генов", - пояснил Чжан. "ФТ контролируют уровень экспрессии генов, выключая и включая их в ответ на стимулы окружающей среды. Однако этот контроль не всегда является прямым. Последующие эффекты активации одного ФТ могут затрагивать множество ФТ и генов".
Чжан отметил, что регуляция генов - это не универсальное явление, а скорее тонко настроенный процесс, зависящий от внешних воздействий. Поскольку сеть регуляции генов имеет сложную структуру, прежние инструменты для ее изучения оказывались обременительными с точки зрения затрат времени и сил. Благодаря возможности точного воздействия на отдельные ФТ с помощью CRISPR и регистрации последующих эффектов для всех комбинаций ФТ и промоторов, PPTP-seq позволяет выявить реакцию различных промоторов в разных условиях, что подчеркивает динамическую природу экспрессии генов даже у простых организмов.
"В конечном итоге PPTP-seq позволяет проводить исследования в области системной биологии с гораздо большей эффективностью - в 50 раз выше, чем существующие подходы", - подчеркнул Чжан. "Наша работа позволила выявить обширную сеть регуляторных реакций у бактерий, включающую множество ранее неизвестных реакций". Такое более глубокое понимание клеточной регуляции может иметь далеко идущие последствия для таких областей, как биотехнология и медицина. Чжан, в частности, указал на потенциальные возможности применения в биотехнологии, где вновь обнаруженные ответные реакции могут быть использованы для программирования бактерий на производство необходимых материалов даже в неидеальных условиях. Помимо бактерий, PPTP-seq может быть использован для изучения более сложных клеток, включая клетки животных.
"Большое преимущество технологии PPTP-seq заключается в том, что мы изучаем всю сеть регуляции генов за один раз, единообразно проверяя все взаимодействия при различных условиях, что позволяет проводить прямые сравнения", - отметил Чжан. "Сейчас это фундаментальная наука. Мы рассматриваем E. coli в качестве модельного организма, поскольку она уже хорошо изучена, но мы все равно открыли в ней что-то новое. Это говорит о том, что мы сможем узнать еще больше, когда перейдем к другим клеткам и другим областям применения".
