Коммерческий успех РНК-вакцин против COVID-19 оживил интерес к кольцевым РНК как к следующему поколению терапевтических препаратов.
Вакцины на основе РНК стали героями пандемии COVID-19. Они установили рекорд по количеству выпущенных лекарственных препаратов, а их разработка была отмечена Нобелевской премией по физиологии и медицине, присужденной в этом году. Однако давно было известно, что у этой технологии есть ключевой недостаток: РНК в своей обычной линейной форме недолговечна. Уже через несколько часов ферменты в клетках набрасываются на молекулу, разрывая ее на части.
Быстротечность жизни РНК не является большой проблемой для вакцин: она должна кодировать белки лишь на короткое время, чтобы вызвать иммунный ответ. Но для большинства терапевтических применений было бы гораздо лучше иметь РНК, которая могла бы существовать дольше. Именно в этом случае на помощь приходят кольцевые или циркулярные РНК. Если связать концы РНК-транскрипта вместе, то многим ферментам, разрушающим РНК, не за что будет зацепиться зубами. В виде кольца РНК приобретает стабильность и долговечность, что теоретически может повысить ее терапевтический потенциал даже при малых дозах.
"При однократной доставке можно получить достаточно долговечный белок", - считает Говард Чанг, молекулярный генетик из Медицинской школы Стэнфордского университета и научный соучредитель компании Orbital Therapeutics - одной из дюжины или более биотехнологических фирм, которые в настоящее время занимаются разработкой терапевтических препаратов на основе модифицированной кольцевой РНК. За последние три года эти биотехнологические компании привлекли в общей сложности более 1 млрд. долларов США венчурного финансирования, и многие крупные фармацевтические компании также начали осваивать эту технологию. Ими движет убежденность в том, что все, что может сделать линейная РНК, ее более жизнеспособный кольцевой аналог может сделать еще лучше.
Сторонники этой идеи предполагают, что циркРНК станет предпочтительной РНК-платформой для лекарственной индустрии и позволит создавать различные препараты - от вакцин нового поколения и препаратов для лечения редких заболеваний до противораковых средств и т.д. Первые испытания таких лекарств на людях начались в августе. Однако кольцевые РНК еще далеки от того, чтобы совершить революцию или реализовать обещание о создании 100 новых лекарственных программ к концу десятилетия, как предсказывает одна из начинающих компаний. Однако вопрос о том, позволит ли дополнительная устойчивость циркРНК превзойти другие терапевтические подходы длительного действия, такие как традиционная генная терапия или новые методы редактирования генов, остается открытым.
"Не поймите меня неправильно, я не считаю, что циркулярная РНК - это "ерунда", - говорит Джейк Бекрафт, соучредитель и руководитель Strand Therapeutics, компании, занимающейся синтетической биологией, которая использует циркулярную РНК в некоторых своих лекарственных программах. "Но существует невероятное количество проблем, которые люди совершенно не замечают".
Первые кольцевые РНК в природе были обнаружены исследователями в 1976 году, когда группа ученых из Германии описала в растениях ряд небольших вирусоподобных РНК-патогенов, имеющих замкнутую петлеобразную форму. Пятнадцать лет спустя исследователи идентифицировали эти молекулы в клетках человека и других млекопитающих. Однако только в 2010-х годах исследователи смогли по-настоящему оценить масштабы распространения кольцевых РНК в различных типах клеток и выявить их многогранную роль в управлении биологической активностью. В основном они связываются с регуляторными молекулами, опосредуя экспрессию генов. Однако некоторые кольцевые РНК могут также кодировать белки, что, как вскоре поняли ученые, может иметь терапевтический потенциал, если только у них будет возможность создавать кольцевые РНК с нуля.
В клетках кольцевые РНК возникают в результате нетрадиционного способа обработки мессенджерной РНК, известного как обратный сплайсинг. Обычно сплайсинг РНК происходит подобно монтажу фильма: некодирующие сегменты вырезаются, а оставшиеся кодирующие части соединяются вместе. Но в некоторых случаях РНК делает неожиданный поворот, складываясь сама с собой, отщепляясь и образуя самостоятельную петлю. Для обратного сплайсинга требуется сложный танец различных белков, которые естественным образом присутствуют в клетках, но не всегда доступны на лабораторном столе. Поэтому в начале 1990-х годов исследователи предложили два возможных варианта создания синтетических кольцевых РНК.
Один из них использует мостики ДНК для удержания концов нити РНК вместе, в то время как другой фермент запечатывает ее - процесс, известный как лигирование. В другом случае используются ферментативные свойства самих специализированных последовательностей РНК. Когда две такие последовательности соединяются, они могут инициировать реакции перекрестного соединения, образуя кольцо.
В 1995 г. группа специалистов из Университета Колорадо в Денвере придумала, как синтезировать белки из таких лабораторных колец, используя специализированную последовательность IRES. Сокращаясь от внутреннего участка входа в рибосому, IRES позволяет рибосоме - белковой машине клетки - связываться с кольцевым транскриптом РНК и начинать непрерывную выработку белков. "Рибосоме никогда не нужно отсоединяться", - поясняет Грейс Чен, биолог РНК из Медицинской школы Йельского университета. Однако исследователи могли создавать только короткие кольцевые последовательности - как правило, не более нескольких сотен нуклеотидов. И в течение последующих 20 лет эта область была ограничена этими размерами, что делало невозможным создание длинных транскриптов, кодирующих белки, необходимых для лечения таких заболеваний, как муковисцидоз или гемофилия.
Алекс Весселхофт решил изменить эту ситуацию. Работая аспирантом в Массачусетском технологическом институте, Весселхофт начал с метода лигирования, но он оказался неэффективным для больших колец. Как и при завязывании длинной ленты в бант, трудности с обработкой концов становятся все более очевидными по мере увеличения размера РНК, что затрудняет получение хорошо сформированной петлевой структуры.
Перейдя к методу самосплайсинга, Весселхофт сконструировал нити РНК с белок-кодирующими участками и IRES-элементами, фланкированными самосплайсирующими последовательностями, как это делали и другие. Но в сотрудничестве с биоинженерами Петром Ковальским и Дэном Андерсоном он также добавил комплементарные участки РНК и спейсерные последовательности в различных местах молекулы, что позволило стабилизировать закольцованную структуру.
Это позволило добиться существенных изменений. Теперь синтетическая РНК могла эффективно закольцеваться даже с более длинными последовательностями. Эксперименты на мышах показали, что такие кольцевые РНК могут вызывать выработку белка в течение нескольких дней, в то время как линейные мРНК дают белок только в течение 24 часов. Метод циркуляризации, о котором впервые было сообщено в 2018 году, быстро стал основным методом синтеза циркРНК in vitro. "Это действительно сделало все более эффективным", - рассказывает Джейсон Рауш, биохимик РНК из Национального института рака США, который использовал эту методику для собственного проекта по синтезу циркРНК.
В 2019 году Весселхофт основал компанию для коммерциализации этой платформы. Первоначально компания называлась Oroboros Bio в честь мифической змеи, которая образует кольцо, чтобы поглотить свой собственный хвост, но позже она сменила название на Orna Therapeutics. Возглавив отдел молекулярной биологии компании Orna, Весселхофт продолжал совершенствовать и оптимизировать процесс. В конце концов, он создал сверхдлинную циркулярную РНК, кодирующую дистрофин - массивный белок, дефицит которого наблюдается при мышечной дистрофии Дюшенна. Транскрипт содержал почти 12 000 нуклеотидов. По словам Весселхофта, "дистрофин - это самая большая вещь в человеческом геноме, которую вы могли бы экспрессировать".
Однако Orna была не единственной компанией, оттачивающей свое мастерство закольцовывания, и другие компании применяли различные подходы к созданию циркРНК. Некоторые компании помещают инструкции по созданию циркРНК в вирусные векторы или ДНК-кассеты, а затем позволяют сплайсингу происходить в клетке. "Наш вирус делает за нас грязную работу", - поясняет Аравинд Асокан, вирусолог-синтетик из Университета Дьюка и соучредитель компании Torque Bio. "Он фактически делает кольцо внутри ядра". Другая компания, Chimerna Therapeutics из Нью-Йорка, использует для производства циркРНК генетически модифицированные бактерии, что, по словам ее руководителя Брайана Пикеринга, является "огромной экономией средств и времени" по сравнению с молекулами, полностью созданными в лаборатории.
Однако большинство компаний используют протокол Весселхофта. В августе команда биотехнологической компании Rznomics из Соннама (Южная Корея) описала систему циркуляризации РНК, которая позволяет не оставлять в кольцевой РНК нежелательных самосплайсирующих последовательностей. Исследователи двух китайских компаний - CirCode Biomedicine и Suzhou CureMed Biopharma Technology - в прошлом году отдельно опубликовали препринты, в которых описываются аналогичные подходы. "По словам Чиджана Зуо, руководителя отдела исследований и разработок компании Suzhou CureMed, конечная циркулярная РНК содержит только кодирующую область и IRES и не имеет никаких нежелательных последовательностей или артефактов".
Удаление этих лишних последовательностей может гарантировать, что циркРНК не будут провоцировать нежелательные иммунные реакции, которые могут снизить их терапевтическую эффективность. "Это важно, если вы хотите получить терапию, которую можно будет проводить снова и снова в течение всей жизни", - комментирует Томас Киркегаард Йенсен, один из руководителей компании Aloop Therapeutics (Копенгаген), занимающейся лечением редких генетических заболеваний с помощью циркулярных РНК. "Нам действительно необходимо продумать каждый элемент, способствующий иммуногенности, и постараться максимально снизить его влияние", - говорит он.
Однако данные о том, вызывают ли циркРНК иммунитет, расходятся. Линг-Линг Чен, биолог по РНК из Шанхайского института биохимии и клеточной биологии, говорит: "Это действительно зависит от того, как вы делаете кольца". В работе, впервые опубликованной в Интернете в 2021 г., она и ее коллеги подробно описали, как последовательности, оставляемые мотивами самосплайсинга, искажают сворачивание РНК, в результате чего образуются кольца с неупорядоченной структурой, вызывающие иммунную реакцию. Однако примерно в то же время биохимик РНК Оливер Россбах и его коллеги из Гессенского университета им. Юстуса Либиха (Германия) сообщили, что причиной этого, скорее всего, являются контаминация, и что реакцию можно свести к минимуму или вовсе исключить при правильной очистке. "Все должно быть очень чисто, - считает Россбах.
Тем не менее, в некоторых случаях иммунная реактивность может быть желательной. В случае вакцин - как против рака, так и против инфекционных заболеваний - провоцирование иммунной системы может стимулировать выработку антител и Т-клеток. Именно это обнаружили Вэньшэн Вэй, специалист по редактированию генома из Пекинского университета, и его коллеги при разработке вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 с использованием циркулярной РНК.
В экспериментах на мышах и обезьянах вакцина с циркРНК вызывала выработку большего количества антител, уничтожающих вирус, чем линейная вакцина из того же типа модифицированной мРНК, что и одобренная вакцина COVID-19, и приводила к более мощному Т-клеточному ответу. В качестве дополнительного бонуса можно отметить, что циркРНК более стабильна, чем мРНК, при температуре окружающей среды, что потенциально позволяет хранить и транспортировать вакцину без необходимости создания "холодовой цепи".
Компания, которую основал Вэй, - пекинский стартап Therorna - в настоящее время проводит испытания этой вакцины на людях. Считается, что это первое испытание синтетического препарата с циркРНК на людях. В следующем году в клинику может поступить еще несколько препаратов, в том числе противораковая терапия от компании Suzhou CureMed, кодирующая иммуностимулирующую молекулу интерлейкин-12. Компания Orna также готовится начать испытания в 2024 г. кольцевой РНК, которая перепрограммирует иммунные клетки на борьбу с раком крови. На конференции, состоявшейся в мае, ученые Orna продемонстрировали, что этот кандидат в циркРНК, даже при введении малых доз, способен уничтожать опухоли в мышиной модели лейкемии без сложной клеточной инженерии и интенсивных подготовительных лекарственных режимов, которые требуются для большинства аналогичных иммунных терапий, доступных сегодня.
Синтетические циркРНК могут не только кодировать терапевтические белки. Складываясь в определенные формы, молекулы могут действовать подобно антителам и связываться непосредственно с мишенями, создавая тип лекарственного средства, известный как аптамер. Они могут захватывать и секвенировать различные виды регуляторных молекул, эффективно удаляя их из клеточной среды. Они также могут выступать в качестве "антисмысловых агентов", связываясь с транскриптами генов и блокируя или изменяя их экспрессию. Кроме того, они могут служить направляющими молекулами для РНК-редактирующих приложений, направляя специализированные ферменты на мутировавшие транскрипты генов, нуждающихся в коррекции. Все эти направления активно исследуются различными стартапами.
Однако наибольшие инвестиции направлены на экспрессию белков, поэтому значительная часть исследований и разработок на начальном этапе была сосредоточена на поиске путей повышения эффективности производства платформы циркРНК. "Если провести достаточную оптимизацию, она может стать более надежной", - говорит соучредитель компании CirCode Зефенг Ванг, биолог РНК из Института вычислительной биологии в Шанхае.
Для большинства исследовательских групп этот процесс начинается с IRES. Например, в результатах, впервые опубликованных в прошлом году, Чанг и его коллеги систематически охарактеризовали десятки IRES-элементов различных вирусов, обнаружив множество из них, обеспечивающих более надежную экспрессию белков, чем те, которые обычно используются в научном сообществе. Настроив еще несколько элементов конструкции, они также успешно усилили производительность циркРНК в несколько сотен раз, что привело к достижению стабильного уровня белка в течение нескольких дней. "Усовершенствования носят модульный характер, - поясняет Чанг. "Они как бы накладываются друг на друга".
Однако прогресс в этой области достигался постепенно, и, по мере того как она становилась все более зрелой, она сталкивалась с некоторыми трудностями. В июне появились новости о проблемах с достоверностью данных в Laronde, одном из самых щедро финансируемых стартапов в этой области. В результате компания была вынуждена отказаться от одной из своих самых передовых программ по созданию лекарств. По словам генерального директора Laronde Джона Мендлейна, эти неудачи "не являются показательными ни для сегодняшней компании, ни для науки, ни для людей". Тем не менее, этот инцидент заставил некоторых наблюдателей усомниться в потенциале циркРНК.
Но ведь кольца и линии - не единственные способы кодирования терапевтических средств на основе РНК. Многие исследователи утверждают, что для превращения синтетической РНК в жизнеспособный метод лечения многих хронических заболеваний потребуются еще более долговечные технологии, такие как самовоспроизводящиеся РНК, способные копировать себя в клетке.
Однако Весселхофт, который в настоящее время является директором отдела РНК-терапии в Институте генной и клеточной терапии в Кембридже, по-прежнему уверенно смотрит на кольцевые молекулы. Даже несмотря на все успехи линейных мРНК-вакцин, он считает, что за кольцевыми РНК будущее.
"Скоро это будет самая популярная технология РНК-терапии", - уверен он.
