Helicobacter pylori (H. pylori) - один из самых распространенных патогенов во всем мире, который заразил около 50% населения планеты.
Он колонизирует желудок человека, и, хотя у большинства людей (>80%) может оставаться бессимптомным на протяжении всей жизни, он в значительной степени влияет на развитие заболеваний желудочно-кишечного тракта. При отсутствии лечения его проявления могут варьировать от таких патологий, как хронический гастрит, пептические язвы, атрофический гастрит, до кишечной метаплазии, рака желудка и слизисто-ассоциированной лимфоидной ткани.
Основой лечения H. pylori являются антибиотики. Наиболее часто используются макролиды (кларитромицин или азитромицин), имидазолы (метронидазол или тинидазол), амоксициллин, тетрациклин и левофлоксацин. Были оценены различные схемы, такие как тройная терапия, последовательная терапия, четверная терапия и тройная терапия на основе левофлоксацина. Тем не менее, успешная схема эрадикационного лечения еще не реализована из-за растущей резистентности к антибиотикам, включенным в текущие схемы. В результате во всем мире наблюдается значительное снижение эффективности лечения H. pylori, что делает эрадикацию H. pylori важной проблемой общественного здравоохранения.
Необходимы более активные усилия для улучшения диагностических инструментов для H. pylori, а также для более четкого понимания развития и распространения резистентных к препаратам бактерий. Аналогичным образом, изучение чувствительности к антибиотикам имеет ключевое значение для внедрения наиболее подходящих методов лечения и определения рекомендаций по лечению, поскольку выбор антибиотиков должен осуществляться с учетом местной резистентности.
Клинические тесты для идентификации H. pylori, которые также полезны для определения чувствительности к антибиотикам, включают культуру, как традиционный метод, и молекулярные методы, обычно предполагающие биопсию желудка. Хотя бактериологическая культура считается эталонным методом диагностики инфекции, H. pylori считается требовательной бактерией, поскольку для ее роста необходимы дополнительные средства, микроаэрофильная атмосфера и длительная инкубация, что приводит к временным ограничениям при проведении исследований чувствительности. В связи с техническими трудностями культивирования H. pylori становится очевидным, что для выявления H. pylori и определения ее резистентности необходимы более простые и быстрые методы. В этом отношении молекулярные методы показали замечательные результаты.
В этой статье кратко изложена наша сегодняшняя точка зрения на молекулярные методы с акцентом на полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ее применение как для диагностики инфекции H. pylori, так и для прогнозирования ее резистентности к антибиотикам.
Полимеразная цепная реакция для детекции Helicobacter pylori
В последние годы было разработано множество молекулярных методов в качестве альтернативы для идентификации H. pylori. Большинство из них основаны на ПЦР или ПЦР в реальном времени (RT-PCR) непосредственно из биоптатов желудка. Среди других молекулярных методов, которые были опробованы, - вложенная (гнездовая) ПЦР, капельная цифровая ПЦР, флуоресцентная гибридизация in situ и секвенирование нового поколения, такое как секвенирование ампликонов 16S рРНК, транскриптомика и метагеномика (Gong and El-Omar, 2021).
Для идентификации H. pylori существует несколько молекулярных анализов, доступных на коммерческой основе. Выделение генетического материала (ДНК) непосредственно из образца позволяет обнаружить H. pylori путем амплификации определенных генов, в основном консервативных областей генома H. pylori. Наиболее используемыми генами являются ureA, ureC, glmM и Hsp60 или регионы 16SrRNA или 23S rRNA (Clayton et al., 1991; Wang et al., 2015; Sulo and Šipková, 2021). Преимущество молекулярно-биологических методов перед другими методами заключается в повышении чувствительности и в том, что они могут позволить количественно оценить бактерии. Однако ложноотрицательные и ложноположительные результаты могут возникать из-за используемых праймеров, вследствие полиморфизма или использования неспецифических праймеров, соответственно (Sulo and Šipková, 2021).
Предполагается, что вложенная ПЦР может достичь достаточной специфичности и является гораздо более чувствительной, чем обычная ПЦР, поскольку она включает два раунда амплификации, что позволяет амплифицировать целевую последовательность в меньшей концентрации. Кроме того, сочетание нескольких целевых генов для детекции, таких как ureA, ureC, glmM, Hsp60, 16S рРНК, 23S рРНК и vacA, может помочь улучшить эффективность диагностики за счет снижения количества ложноположительных результатов (Wang et al., 2015; Wongphutorn et al., 2018).
С другой стороны, в качестве альтернативы использованию образцов биопсии желудка были опубликованы различные исследования, в которых ПЦР проводится на желудочном соке (Hsieh et al., 2019) или на неинвазивных образцах, таких как слюна (Sayed et al., 2011) и кал (Beckman et al., 2017; Leonardi et al., 2020), с полученными многообещающими результатами. До сих пор существуют различные показатели чувствительности и специфичности в зависимости от метода выделения ДНК и используемого ПЦР-анализа. Другие выявленные ограничения включают требования к оборудованию и экспертам, меньшую численность бактерий, присутствие ингибирующего вещества, а также помехи от мертвых бактерий или деградации ДНК.
Полимеразная цепная реакция для выявления резистентности
Молекулярные методы также позволяют выявить резистентность к антибиотикам. Штаммы H. pylori выработали различные механизмы антибиотикорезистентности, такие как точечные мутации или другие генетические изменения. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этой резистентности, интенсивно изучаются, особенно в случае кларитромицина и левофлоксацина, наиболее часто используемых антибиотиков для эрадикации H. pylori, учитывая, что подавляющее число случаев резистентности к этим двум антибиотикам обусловлено известными локализованными мутациями.
Таким образом, нацелившись на гены, ответственные за резистентность к антибиотикам, можно получить информацию о генотипической восприимчивости к широко используемым антибиотикам без постановки антибиограммы. Более того, выявление генов и мутаций, вовлеченных в антибиотикорезистентность, с помощью молекулярных методов уже признано полезным инструментом, который можно проводить непосредственно на образце биопсии желудка в соответствии с V Маастрихтским/Флорентийским консенсусом (Malfertheiner et al., 2017).
Полимеразная цепная реакция является наиболее широко используемым подходом к молекулярному анализу. Доступно несколько коммерческих наборов для выявления различных мутаций, которые придают резистентность к кларитромицину в сочетании или без него с левофлоксацином. ПЦР также применялась для выявления резистентности к тетрациклину и рифампицину по собственным протоколам, которые в основном описаны в литературе (Chisholm and Owen, 2009; Contreras et al., 2019).
Применительно к кларитромицину большинство методов идентифицируют основные мутации, которые обнаруживаются в гене 23S рРНК, нацеливаясь на точечные мутации в нуклеотидных позициях A2146 и A2147. Эти две мутации ранее были названы 2,142 и 2,143. Со своей стороны, резистентность к фторхинолонам в очень значительном проценте обусловлена мутациями в генах gyrA и gyrB ДНК-гиразы, позиции 86, 87, 88 и 91. Также методы ПЦР применялись для выявления резистентности к тетрациклину (Contreras et al., 2019) из-за мутаций в гене 16S рРНК (позиции 926-928) и рифампицину в гене rpoB (позиции 525-545 и 547) (Chisholm and Owen, 2009). Что касается метронидазола, то механизмы его резистентности довольно сложны и не так хорошо изучены, поэтому на данный момент не существует коммерческих наборов для его выявления.
Полимеразная цепная реакция в сравнении с культурой
Учитывая вышеизложенное наблюдение, мы сравнили эффективность выявления H. pylori между культурой и молекулярным набором для выявления H. pylori GenoType® HelicoDR (HAIN Life Science). Что касается резистентности к антибиотикам, фенотипическая восприимчивость была изучена у всех культурально-позитивных и сравнивалась с набором GenoType® HelicoDR, который позволяет одновременно выявлять H. pylori и ее резистентность к кларитромицину и левофлоксацину и применим к образцам биоптатов желудка. Тест Genotype® HelicoDR позволяет выявить точечные мутации, ответственные за резистентность к кларитромицину и левофлоксацину: три точечные мутации в домене V гена 23S рРНК (позиции 2,146 и 2,147) для кларитромицина и 4 мутации в субъединице А ДНК-гиразы (1 в кодоне 87 и 3 в кодоне 91) для хинолонов.
Пациенты и методы
Для исследования использовались образцы биопсии желудка, взятые у 616 пациентов в возрасте от 2 до 82 лет, которым была проведена эндоскопия по поводу заболеваний гастродуоденальной зоны. Анализировался один образец от каждого пациента. Были собраны данные, включая возраст и пол. Исследование проводилось с января 2016 года по октябрь 2017 года, образцы были собраны в различных испанских больницах. Образцы биопсии желудка пациентов были направлены в лабораторию клинической микробиологии Hospital Universitario La Princesa в Мадриде. Свежесобранные биоптаты помещали либо в раствор Portagerm Pylori (BioMérieux) и отправляли в течение 24 часов при комнатной температуре, либо в стерильные стеклянные пробирки и хранили при 4°C. По прибытии в лабораторию, если в течение 3 ч процедура теста не могла быть проведена, образцы хранились при температуре -80°C в морозильной камере до дальнейшей процедуры.
Исследование чувствительности к антибиотикам проводилось методом градиентной диффузии на чашках с кровяным агаром. Полученные изоляты H. pylori были исследованы на чувствительность к антимикробным препаратам методом градиентной диффузии (E-test, BioMérieux) на кровяном агаре, инкубированном при 37°C в микроаэробной атмосфере (5% O2, 10% CO2 и 85% N2). Были протестированы шесть антимикробных препаратов: кларитромицин, метронидазол, амоксициллин, левофлоксацин, тетрациклин и рифампицин, на которых значения МИК считывались через 3 и 5 дней и интерпретировались в соответствии с клиническими рекомендациями EUCAST.
Для молекулярного метода выделение ДНК включало предварительный этап, предназначенный для расщепления белков. Твердые биоптаты смешивали с протеиназой К, буфером для лизиса и дистиллированной водой, после чего инкубировали при перемешивании не менее 3 ч при 37°C. Выделение ДНК проводили путем автоматизированной экстракции ДНК с помощью NucliSens® easyMAG™ (BioMérieux), следуя описанию производителя для данных тканей. Все выделенные ДНК хранили при -80°C.
В качестве исходного материала можно использовать как сам биопсийный материал, так и выделенный из него культуральный материал. Проводилась мультиплексная амплификация интересующих областей ДНК. Типичные реакционные смеси для ПЦР содержали 5 мкл реакционного буфера, 2,5 мкл MgCl2, 35 мкл 5′-биотинилированных праймеров и смеси нуклеотидов, 0,4 мкл Taq-полимеразы, 2,5 мкл воды для ПЦР и 5 мкл выделенной ДНК. ПЦР состояла из 30 циклов. Цикл денатурации состоял из 1 цикла при 94°C в течение 5 мин. Затем 30 циклов, состоящих из первого этапа при 94°C в течение 30 с, второго этапа при 55°C в течение 30 с и третьего этапа при 72°C в течение 30 с. ПЦР заканчивалась 7 мин при 72°C. Тест был разработан и интерпретирован в соответствии с инструкциями производителей.
За ПЦР следовала гибридизация с полосками ДНК, покрытыми различными специфическими олигонуклеотидами (зондами). Гибридизацию проводили с использованием системы TwinCubator (Hain Life Science) при температуре 45°C. Денатурирующий раствор смешивался с 20 мкл амплифицированного образца и гибридизировался по стандартному протоколу гибридизации. Каждая полоска содержала в общей сложности 18 гибридизационных зондов. Первая полоска содержит конъюгатный контроль, предназначенный для индикации эффективного связывания с субстратом. Вторая полоска включает универсальный контроль и используется для проверки правильности проведения амплификации. Третья полоска содержит последовательность из области 23S рРНК, которая является общей для всех штаммов H. pylori. Следующие десять и пять полосок предназначены для исследования чувствительности к хинолонам и кларитромицину, соответственно. Зонды были разработаны для гибридизации с сиквенсами как дикого типа (WT), так и мутировавших аллелей (MUT).
Интерпретация проводилась после гибридизации, при этом шаблон выравнивался бок о бок с контрольной конъюгированной группой соответствующей полоски. Контрольные полоски должны быть положительными для подтверждения теста. Положительная полоска определялась путем сравнения пятна каждой полосы с контрольной полоской амплификации. Более сильное окрашивание по сравнению с контрольной полоской амплификации интерпретировалось как положительное на наличие аллеля. WT образцы определялись только по наличию WT полосок. Мутации штаммов H. pylori включали резистентность к кларитромицину, резистентность к фторхинолонам и резистентность к обоим антибиотикам. Мутанты определялись по наличию полоски MUT.
Результаты
Всего 616 образцов были исследованы на наличие H. pylori двумя методами. Результаты показывают, что 234 (37,9%) образца были признаны положительными на наличие бактерии H. pylori обоими методами, а 308 (50%) - отрицательными. Что касается выявленных расхождений, 2 (0,32%) образца были обнаружены только с помощью культуры. Напротив, 72 (11,6%) образца были признаны положительными только с помощью ПЦР. Если рассматривать культуру как золотой стандарт, то сравнение показало чувствительность 99,1% и специфичность 81% в пользу молекулярного теста. Следует отметить, что положительные результаты ПЦР и отрицательные результаты культуры не были ложноположительными, поскольку ПЦР был способен выявить больше положительных результатов, чем культура.
Что касается тестирования чувствительности с помощью Е-тестов, не удалось определить антибиотикочувствительность 236 изолятов ко всем антибиотикам; только 223 изолята можно было исследовать на кларитромицин и левофлоксацин. Для кларитромицина чувствительный фенотип имели 107 (47,9%) изолятов, а для левофлоксацина - 206 (92,3%) изолятов. Несмотря на выделение H. pylori в культуре из 236 штаммов, антибиограмма была доступна не для всех из них. Изучить фенотипическую чувствительность удалось только у 223 штаммов, а у 13 штаммов антибиограмма оказалась непригодной.
Резистентность к кларитромицину составила 52% для фенотипического метода и 59% для генотипического метода, а к левофлоксацину - 76% для фенотипического метода и 84% для генотипического метода (статистически значимых различий нет).
На основании этих результатов была рассчитана чувствительность 99,1% и специфичность 80% для выявления резистентности к кларитромицину методом генотипической ПЦР. Для левофлоксацина не наблюдалось расхождений между двумя методами, поэтому чувствительность и специфичность для выявления резистентности к левофлоксацину методом ПЦР составили 100%.
Обсуждение
Эффективная диагностика необходима для успешного клинического лечения с целью облегчения симптомов и эрадикации бактерий. Как и любой другой метод диагностики, культуральный и молекулярный методы имеют не только преимущества, но и недостатки.
Молекулярные методы диагностики H. pylori имеют очень высокую чувствительность (более 95%), выявляя больше положительных образцов, чем культура, и специфичность (близкую к 100%). Методы ПЦР не зависят от лабильности бактерий, как это происходит при культивировании. Кроме того, некоторые молекулярные методы могут применяться непосредственно на образце, биопсии желудка или неинвазивных образцах. Более того, что касается времени работы, амплификация геном-специфических регионов в H. pylori с использованием соответствующих праймеров позволяет быстрее идентифицировать бактерию, чем культура, так как для отрицательной культуры H. pylori требуется 10-14 дней.
Преимущества генотипических методов перед фенотипическими заключаются в том, что они позволяют получить представление об основных механизмах резистентности за достаточно короткое время (<4 ч). В то же время, среди недостатков - более высокая цена по сравнению с традиционными методами и необходимость наличия соответствующего оборудования и опытного персонала. Это основная причина, по которой подходы с использованием амплификации ДНК не получили широкого распространения в общей практике.
Стоит упомянуть, как альтернативу использованию биопсии желудка, появление ПЦР для диагностики H. pylori непосредственно из неинвазивных образцов. Это может стать большим прогрессом, поскольку позволяет избежать необходимости проведения эндоскопии и биопсии, тем самым предотвращая весь дискомфорт и риски, которые они влекут за собой для пациента, а также связанные с этим расходы.
Кроме того, молекулярные методы имеют ограничения, когда речь идет о выявлении резистентности к антибиотикам. Основной недостаток ПЦР в выявлении резистентности по сравнению с культурой H. pylori заключается в том, что большинство коммерческих систем выявляют только специфические мутации резистентности к кларитромицину и хинолонам, в то время как культура позволяет исследовать чувствительность ко всем антибиотикам и выявлять резистентные изоляты по другим мутациям или механизмам резистентности. Они выявляют только специфические мутации, поэтому существует возможность не выявить резистентные изоляты, обусловленные мутациями, отличными от тех, которые амплифицируются с помощью ПЦР, или резистентные изоляты, обусловленные другими механизмами резистентности.
В заключение следует отметить, что оба метода по-прежнему необходимы для изучения чувствительности, и ни один из них не должен быть исключен. Эти методы могут стать важным компонентом усилий, необходимых для предотвращения дальнейшего развития инфекций, вызванных H. pylori, и распространения растущей резистентности к антибиотикам.
